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文檔簡介
1、目的:肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種進行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,選擇性損害脊髓前角的運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核運動神經(jīng)元及大腦運動皮層的大錐體細胞,表現(xiàn)為進行性加重的肌肉無力、肌肉萎縮、肌束震顫、腱反射亢進,病理征陽性,最終呼吸衰竭死亡。90%~95%的ALS為散發(fā)性,5%~10%的ALS為家族性,約20%的家族性ALS與Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關。目
2、前該病發(fā)病機制尚不清楚,但殘存運動神經(jīng)元中存在泛素陽性包涵體是ALS的重要病理特征之一。
泛素是真核細胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白質,其分子量約8.5K Da,由76個氨基酸殘基組成,能夠共價結合細胞中的受體蛋白。泛素與泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、去泛素化酶、蛋白酶體及其底物(蛋白質)構成泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)。UPS是細胞內
3、蛋白質降解的主要途徑,參與細胞內80%以上蛋白質的降解。大量研究認為UPS在錯誤折疊蛋白或其他突變蛋白的降解過程中也發(fā)揮重要作用。泛素蛋白酶體降解通路失調可導致異常蛋白在細胞內積聚,并進一步引起細胞功能紊亂及變性。UPS功能異常可以發(fā)生于UPS途徑的任何一個環(huán)節(jié),如泛素化過程中泛素量的失衡,泛素結合過程中泛素活化酶E1,泛素結合酶E2,泛素連接酶E3功能失調,蛋白酶體降解水平失調或去泛素化水平失調等。實驗表明,在ALS包涵體中所見的泛素
4、連接酶Dorfin能特異性結合并泛素化各種突變的SOD1,對野生型SOD1無影響。過量的Dorfin可減少SOD1包涵體的形成,從而保護神經(jīng)元免受SOD1毒性的損害。因此,泛素蛋白酶體降解系統(tǒng)和ALS的發(fā)病可能存在密切關系。
本實驗應用家族性肌萎縮側索硬化動物模型(SOD1G93A轉基因小鼠)觀察泛素在ALS病程不同階段的表達情況,旨在探討泛素蛋白在ALS的發(fā)病中的作用。
方法:飼養(yǎng)繁殖家族性肌萎縮側索硬化動
5、物模型SOD1G93A轉基因小鼠,參考Weydt,P.的描述將SOD1G93A轉基因小鼠分為癥狀前期(60天),癥狀早期,終末期。對照組動物為實驗組小鼠同窩非轉人突變SOD1基因小鼠。
1 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,心臟灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常規(guī)組織切片(5μm厚)。5μm厚的石蠟切片應用免疫組織化學SP的方法顯示泛素
6、在SOD1G93A轉基因小鼠不同時期脊髓前角細胞的表達分布形式。
2 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,新鮮取小鼠脊髓腰段,液氮速凍,-80℃儲藏,提取總蛋白用蛋白免疫印跡的方法檢測泛素在SOD1G93A轉基因小鼠不同時期腰段脊髓的表達量的情況。
3 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,新鮮取小鼠脊髓腰段,液氮速凍,-80℃儲藏,提取RNA反轉錄后,擴增目的基因用PCR的方法檢測泛素基因
7、在SOD1G93A轉基因小鼠不同時期脊髓前角的轉錄表達情況。
4 計量資料用x±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。SOD1G93A轉基因小鼠不同時期組與對照組泛素轉錄mRNA水平及蛋白表達水平的總體比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果:
1 泛素免疫組織化學染色結果顯示,對照組小鼠不同年齡階段腰段脊髓前角神經(jīng)元均有泛素表達,無明顯差別。SOD1G
8、93A轉基因小鼠隨病情進展,泛素陽性蛋白表達逐漸聚集,形成泛素陽性聚集體。
2 SOD1G93A轉基因小鼠的腰髓總蛋白免疫印跡結果顯示,隨著病情進展8.5K Da的單泛素及分子量17K Da以上的多聚泛素蛋白水平表達無明顯增加(F=0.241,1.972,P>0.05),無統(tǒng)計學意義。
3 SOD1G93A轉基因小鼠的腰髓mRNA反轉錄后,SOD1G93A轉基因小鼠不同時期組與對照組相比,泛素mRNA-UBA
9、有差異(F=9.938,P<0.05)。癥狀早期SOD1G93A轉基因小鼠與對照組小鼠相比UBA無明顯差異,P=0.08>0.05。癥狀早期與癥狀前期SOD1G93A轉基因小鼠相比UBA表達明顯增加,有統(tǒng)計學意義,P=0.04<0.05。終末期與癥狀前期SOD1G93A轉基因小鼠相比UBA表達明顯增加,有統(tǒng)計學意義,P=0.01<0.05。SOD1G93A轉基因小鼠病情進展過程中,各時期相比及各時期與對照組相比UBB均無明顯差異(F=0
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