神經甾體對大鼠學習記憶的影響及相關作用機制初探.pdf

1、目的：認知功能障礙性疾病特別是阿爾茨海默氏病、血管性癡呆等，是發(fā)生于老年前期和老年期十分常見的神經精神性疾病。其較為突出的臨床特點為進行性學習記憶功能減退、行為障礙、情緒異常等。神經甾體參與焦慮、抑郁等應激情緒反應的調控，以及驚厥、睡眠、神經再生和生物晝夜節(jié)律等的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)神經淄體對學習記憶具有調控作用。孕烯醇酮硫酸酯(pregnenolone sulfate，PREGS)和脫氫表雄酮硫酸酯(dehydroepiandrostero

2、ne sulfate，DHEAS)等神經甾體可協(xié)同促進γ-氨基丁酸受體GABAA的功能、抑制谷氨酸離子型受體NMDA的功能，進而增強神經元的興奮性和突觸可塑性，促進動物覺醒、記憶獲取及鞏固。而側腦室給予別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)可損傷動物的空間認知能力。腦內膽堿系統(tǒng)參與學習、記憶、驚厥和注意力等許多活動。腦內乙酰膽堿(Acetycholine，Ach)水平的平衡對維持腦的高級功能的正常運作至關重要。不同腦區(qū)膽堿

3、功能損傷、膽堿系統(tǒng)代謝酶水平改變以及膽堿能受體數(shù)目減少均與許多認知障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展有關。Morris水迷宮進行的相關行為學評價可以用于疾病相關模型的判斷。M受體東莨菪堿所致學習記憶損傷的大鼠模型被廣泛應用，用以理解發(fā)生在老齡的記憶損害和特定的病理狀態(tài)以及篩選具有促進認知功能的有效藥物。本研究通過制備東莨菪堿所致學習記憶損傷的大鼠模型，測定模型動物的學習記憶能力以及神經甾體水平的變化，并進一步測定給予神經甾體干預后動物行為學及相關酶學

4、指標，以探討神經甾體對東莨菪堿所致學習記憶損傷模型大鼠的影響及其可能的機制，為學習記憶障礙性疾病機制的闡明和神經甾體的臨床應用提供基礎實驗依據。
　　 方法：
　　 1分組和藥物處理方案
　　 1.1東莨菪堿所致學習記憶損傷的大鼠模型的制備
　　 體重200～220g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠16只，隨機分為模型組和生理鹽水對照組，每組8只。在水迷宮實驗前30min模型組每只大鼠按2.0

5、mg·kg-1腹腔注射東莨菪堿，對照組注射相應體積生理鹽水。應用Morris水迷宮行為學實驗對動物的學習記憶能力進行測試，與生理鹽水對照組相比，行為學成績顯著降低表示模型制備成功。
　　 1.2孕酮對學習記憶損傷大鼠的影響及相關機制
　　 40只體重200～220g雄性SD大鼠，隨機分為生理鹽水對照組、模型組、孕酮低劑量組（4mg·kg-1）、孕酮中劑量組（8mg·kg-1）、孕酮高劑量組(16mg·kg-1)，每組8只

6、。水迷宮實驗前60min，孕酮各劑量組每只大鼠背部皮下注射相應劑量孕酮，對照組和模型組大鼠背部皮下注射相應劑量的空白藥用注射用油。實驗前30min，模型組和孕酮各劑量組每只大鼠按2.0mg·kg-1劑量腹腔注射東莨菪堿，對照組大鼠腹腔注射相應體積生理鹽水。
　　 2.指標的檢測
　　 2.1 Morris水迷宮行為學測試
　　 第1～5天進行定位航行實驗。每天在固定時間開始實驗。將大鼠從固定入水點面向池壁放入水中

7、，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間即逃避潛伏期，若大鼠在180s內未尋找到平臺則記錄逃避潛伏期為180s，并引導其尋找到平臺。每只大鼠訓練完畢后無論是否尋找到平臺，均將其放至平臺上停留10s。第7天進行空間探索實驗。定位航行實驗結束后間隔1天撤去平臺，將大鼠從固定入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠第一次到達原平臺所在位置的時間以及其在180s內跨越原平臺所在位置的次數(shù)。
　　 2.2樣品中神經甾體的提取和測定
　　 空間探索實

8、驗結束后將大鼠斷頭處死，取軀干血于肝素管中，并離心取上層血漿備神經甾體檢測使用。迅速剝開顱骨，參考大鼠腦立體定位圖譜，在冰冷的生理鹽水中分離出皮質和海馬，稱重后置于-70℃下保存?zhèn)渖窠涚摅w檢測使用。參考本實驗室已建立的方法稍加改進，使用乙酸乙酯/正己烷(9/1，v/v)液液萃取和固相小柱兩步法提取神經甾體，采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術測定血漿和腦組織樣品中的神經甾體的含量。
　　 2.3樣品中乙酰膽堿酯酶的測定
　　

9、空間探索實驗結束后將大鼠斷頭處死，迅速剝開顱骨，參考大鼠腦立體定位圖譜，在冰冷的生理鹽水中分離出皮質和海馬，稱重后用生理鹽水制成10％(m/V)組織勻漿，4℃下3500r·min-1離心10min，取上清液參照試劑盒說明書嚴格操作進行反應測定。同時用紫外吸收法測定每個樣本中蛋白含量以進行計算統(tǒng)計。
　　 結果：
　　 1神經甾體測定方法學確證
　　 本實驗所用神經甾體測定方法中DHEA、PREG、AP、PROG和

10、內標MT與腦組織及血漿成分分離效果良好，無干擾。腦組織樣品和血漿樣品中DHEA、PREG、AP和PROG在0.015～4.5ng·ml-1范圍內具有良好的線性關系。腦組織中DHEA、PREG、AP、PROG日內和日間變異系數(shù)分別小于7.6％和7.2％、7.7％和7.9％、8.0％和5.7％、7.9％和4.5％(n=5)；血漿中DHEA、PREG、AP、PROG的日內和日間變異系數(shù)分別小于8.1％和7.0％、6.7％和12.3％、8.0％

11、和6.4％、8.1％和6.6％(n=5)。
　　 2 Morris水迷宮行為學測試結果
　　 定位航行實驗結果顯示，模型組和生理鹽水對照組兩組大鼠尋找到隱匿平臺所需時間即逃避潛伏期均隨學習天數(shù)的增加而呈現(xiàn)縮短趨勢。與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期在第3天開始顯著延長（P＜0.05）?？臻g探索實驗中與對照組相比，模型組大鼠第1次到達原平臺位置時間顯著延長（P＜0.05），跨越原平臺所在區(qū)域次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。說

12、明東莨菪堿所致學習記憶損傷的大鼠模型制備成功。
　　 給予孕酮預處理后，定位航行實驗結果顯示在5天的訓練過程當中隨著訓練時間的延長，各組大鼠的逃避潛伏期均呈現(xiàn)縮短趨勢。與模型組相比，第3天開始，孕酮低、中劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），從第2天開始，孕酮高劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）?？臻g探索實驗中，與模型組相比，孕酮三個劑量組大鼠第1次到達原平臺位置時間均顯著縮短（P＜0.05）。與模型組相比

13、，孕酮低、中劑量組大鼠跨越原平臺所在區(qū)域次數(shù)與模型組有增加趨勢，但差異沒有顯著性（P＞0.05），孕酮高劑量組大鼠跨越原平臺所在區(qū)域次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。
　　 3樣品中神經甾體水平的改變
　　 與生理鹽水對照組相比，東莨菪堿致學習記憶損傷形成時，模型組大鼠額葉皮質內PREG水平顯著下降（P＜0.05），DHEA、AP和PROG水平無顯著性改變；模型組大鼠海馬內DHEA、PREG、AP和PROG水平無顯著改變；模

14、型組大鼠血漿中PROG水平顯著升高(P＜0.05)，DHEA、PREG和AP水平無顯著性改變。
　　 4樣品中乙酰膽堿酯酶水平的改變
　　 與生理鹽水對照組相比，東莨菪堿致學習記憶損傷形成時，模型組大鼠額葉皮質和海馬中AchE活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，孕酮各劑量組大鼠額葉皮質和海馬中AchE活性均降低(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1 M受體拮抗劑東莨菪堿致大鼠學習記憶損傷時，腦

15、內神經甾體合成代謝發(fā)生了明顯改變，大鼠額葉皮質內PREG含量顯著降低。提示神經甾體合成代謝可能參與了M受體系統(tǒng)對學習記憶的調節(jié)過程。
　　 2東莨菪堿致大鼠學習記憶損傷時，外周神經甾體合成代謝也發(fā)生了明顯改變，血漿中PROG水平顯著升高。推測東莨菪堿可能通過拮抗M受體影響內分泌系統(tǒng)，尤其是與甾體激素合成密切相關的HPA軸的活性，參與大鼠學習記憶相關腦區(qū)的調節(jié)。
　　 3外源性PROG干預能通過抑制腦內皮質和海馬組織中Ac