大黃素體外誘導人腎透明細胞癌細胞株786-0凋亡效應及相關通路的實驗研究.pdf

1、目的:
　　研究大黃素體外誘導人腎透明細胞癌細胞株786-0的凋亡作用,并初步探討其誘導腎透明細胞癌細胞凋亡的可能分子機制,旨在為大黃素在抗人腎透明細胞癌方面的臨床應用提供實驗依據,增加對其藥理作用及量效時效關系的深入認識。
　　方法:
　　(1)將同代的人腎透明細胞癌細胞株786-0分組,分為空白對照組,陰性對照組以及藥物作用組(分別為10、20、40、60和80μmol/L組)。
　　(2)普通光學顯微鏡觀察

2、細胞增殖抑制及HE細胞染色觀察。
　　(3)采用DAPI染色進行細胞凋亡形態(tài)學改變檢測。
　　(4)采用CCK法觀察大黃素作用下腎癌細胞的增殖抑制率。
　　(5)利用RT-PCR技術從mRNA水平研究bax、bcl-2的表達差異。
　　(6)利用Western-Blot技術在蛋白水平研究bax、bcl-2的表達差異。
　　(7)采用JC-1探針法明確786-0細胞內線粒體跨膜電位的改變。
　　(8)通

3、過caspase-9、caspase-3活性試劑盒檢測caspase-9、caspase-3上調水平。
　　結果:
　　倒置顯微鏡下觀察,隨著大黃素作用濃度的增加和作用時間的延長,786-0細胞形態(tài)逐漸變圓或者不規(guī)則,胞內空泡增多,部分細胞脫壁并漂浮;而未加藥物的對照組細胞呈上皮型,貼壁生長,細胞輪廓清楚,胞質中無異常顆粒出現,增殖旺盛。HE染色400倍鏡下觀察,可以看到出現波紋狀或呈折縫樣細胞核,染色質高度凝聚、邊緣化,最

4、后細胞核破裂,凋亡小體出現。細胞經DAPI染色后對照組細胞核呈淺藍色染色,細胞核規(guī)則,呈圓形;藥物作用后細胞凋亡明顯增多,凋亡細胞呈現核濃縮,染色加深,或核染色質呈新月形聚集于核膜一邊層不規(guī)則形態(tài)。
　　大黃素對786-0細胞的增殖具有明顯的抑制作用。大黃素作用于786-0細胞24、48、72小時后細胞半數抑制濃度(IC50)分別為:(45.56±2.12)μmol/L、(33.59±1.38)μmol/L、(24.41±1.36

5、)μmol/L,大黃素的對786-0細胞增殖的抑制作用具有時間依賴性及濃度依賴性。大黃素作用786-0細胞24小時后,細胞抑制凋亡因子Bal-2mRNA及蛋白表達水平明顯下調,細胞的促凋亡因子BaxmRNA及蛋白表達水平明顯上調,Bcl-2/Bax的比值明顯下調,其線粒體跨膜電位改變明顯,細胞總數隨作用時間的延長而逐漸減少,紅、綠熒光相對比例隨時間延長而減小,隨劑量增加而減小,去極化率的增高同樣有濃度和時間依賴性。不同濃度的大黃素(10

6、、20、40、60、80μmol/L)作用于786-0細胞后,caspase-9和caspase-3的活性明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01﹚,且隨著大黃素濃度的逐漸增加(40、60、80μmol/L),細胞內caspase-9的相對活性亦逐漸增強。
　　結論:
　　(1)大黃素在體外能誘導人腎透明細胞癌細胞株786-0細胞凋亡,具有典型細胞凋亡形態(tài)學改變。其誘導作用隨時間及濃度的增加而加強。
　　(2)大黃素