miR-155在創(chuàng)面愈合中的作用及機制研究.pdf

1、皮膚組織缺損在臨床上十分常見，一般由各種急、慢性致傷因素，如機械損傷、燒傷、體表腫瘤切除、慢性潰瘍等導致。創(chuàng)面愈合是在多種細胞及細胞因子共同參與下完成的復雜病理生理過程，主要涉及炎癥反應、創(chuàng)面上皮化及收縮、膠原沉積及重塑這三個過程，而這三個過程是相互影響及相互調控的。嚴重創(chuàng)面愈合后往往膠原過度沉積，導致纖維化及疤痕形成，如何在促進創(chuàng)面愈合的同時減輕愈后纖維化程度一直是燒傷及各學科研究的熱點，然而目前仍無理想結果。因此，探索新的促創(chuàng)面愈合

2、、減輕愈后纖維化程度的途徑，是急需解決的重大臨床問題之一。
　　microRNA是一類短鏈非編碼RNA，通過轉錄后水平調控蛋白表達來發(fā)揮功能，在創(chuàng)面愈合及纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。miR-203及miR-210分別通過促進角質形成細胞遷移及增殖來促進創(chuàng)面愈合，而miR-99及miR-200家族則可抑制角質形成細胞遷移而延緩創(chuàng)面愈合。miR-155早期研究主要集中在免疫領域，并發(fā)現(xiàn) miR-155在炎性細胞發(fā)育及免疫反應調控中發(fā)揮重

3、要作用，近期研究還發(fā)現(xiàn) miR-155可以通過促進上皮間質轉化而促進上皮細胞遷移。因此，我們猜測 miR-155可以通過促進角質形成細胞遷移而促進創(chuàng)面愈合，并可以通過調控創(chuàng)面炎性細胞功能而影響創(chuàng)面愈合后纖維化程度，在創(chuàng)面愈合及創(chuàng)面愈后纖維化中發(fā)揮重要作用。
　　本研究擬通過創(chuàng)面局部注射 miR-155 plasmid及 antagomir來調控創(chuàng)面局部miR-155水平，在體內觀察miR-155在創(chuàng)面愈合及愈合后纖維化中的作用，以

4、及體外細胞模型進行驗證，并對其可能機制進行研究。
　　方法：
　　1、在SD大鼠背部造成1×1 cm全層皮膚缺損模型，創(chuàng)面局部注射 miR-155 plasmid后觀察其對創(chuàng)面愈合及上皮化速度的影響；成纖維細胞三維凝膠收縮實驗及體內外α-SMA染色觀察miR-155 plasmid對創(chuàng)面收縮的影響。
　　2、采用角質形成細胞劃痕及Transwell細胞穿膜實驗來觀察miR-155對角質形成細胞遷移的影響；采用Ki-67

5、染色、MTT生長曲線測定及流式細胞周期檢測的方法來觀察miR-155 plasmid對角質形成細胞增殖的影響。
　　3、通過F-actin、E-cadherin、β-catenin、MMPs、TIMPs等與細胞遷移相關蛋白的檢測來探討miR-155 plasmid促進角質形成細胞遷移的可能分子機制。
　　4、SD大鼠創(chuàng)面病理染色觀察miR-155 plasmid對創(chuàng)面炎性細胞浸潤數(shù)量的影響；通過愈后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積水平檢測來觀

6、察 miR-155 plasmid對創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。
　　5、在C57小鼠背部全層皮膚缺損模型中注射miR-155 antagomir并觀察其對創(chuàng)面愈合速度影響；通過創(chuàng)面局部炎性細胞HE及免疫組化染色、炎性因子水平測定來觀察創(chuàng)面局部注射miR-155 antagomir對創(chuàng)面局部炎性細胞功能的影響。
　　6、通過檢測創(chuàng)面愈合后局部Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量、Masson膠原染色來觀察miR-155 antagomir局部注射

7、對C57小鼠背部創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。
　　結果：
　　1、SD大鼠背部全層皮膚缺損模型中，創(chuàng)面局部注射miR-155 plasmid能使創(chuàng)面局部 miR-155水平與對照組相比顯著升高，并且創(chuàng)面愈合速度明顯加快，病理染色顯示miR-155可以明顯促進創(chuàng)面上皮化；miR-155對成纖維細胞三維凝膠收縮、體內外成纖維細胞α-SMA蛋白表達均無明顯影響。結果提示miR-155可以通過加速創(chuàng)面上皮化而促進創(chuàng)面愈合，對創(chuàng)面收縮無

8、明顯影響。
　　2、細胞劃痕及Transwell細胞穿膜實驗證實miR-155可以促進角質形成細胞遷移；miR-155對角質形成細胞Ki-67表達、生長曲線、細胞周期等都無明顯影響。提示miR-155在促進角質形成細胞遷移的同時對角質形成細胞增殖無明顯影響。
　　3、Western blot及免疫組化/熒光染色顯示 miR-155對 E-cadherin、β-catenin、F-actin、MMP-9等蛋白表達均無明顯影響；

9、miR-155能引起MMP-2蛋白表達升高，并且MMP-2特異性抑制劑ARP101能部分抑制miR-155誘導的角質形成細胞遷移增快，提示MMP-2在miR-155誘導的角質形成細胞遷移增快及創(chuàng)面愈合加快中發(fā)揮重要作用，并且還有其他機制參與miR-155誘導角質形成細胞遷移增快。
　　4、SD大鼠皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 plasmid局部注射能增加創(chuàng)面中性粒細胞浸潤數(shù)量，創(chuàng)面愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量也明顯增加。提示miR-155

10、能增強創(chuàng)面局部炎性細胞數(shù)量并導致愈后纖維化程度加劇。
　　5、C57小鼠背部皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 antagomir局部注射能顯著降低創(chuàng)面局部miR-155水平，創(chuàng)面局部中性粒細胞及巨噬細胞浸潤數(shù)量顯著減少，同時促炎因子TNF-α、IL-β水平顯著降低、抑炎因子IL-10水平顯著增加；與對照組相比miR-155 antagomir局部注射對創(chuàng)面愈合速度無明顯影響。結果提示創(chuàng)面局部低表達 miR-155可以調控創(chuàng)面炎性細胞功能

11、但對創(chuàng)面愈合速度無明顯影響。
　　6、C57小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 antagomir局部注射愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原、α-SMA蛋白表達顯著降低，Masson膠原染色提示局部膠原排列更整齊、稀疏，表明miR-155 antagomir可以減輕創(chuàng)面愈后纖維化程度，提高創(chuàng)面愈合質量。
　　結論：
　　創(chuàng)面局部高表達 miR-155能夠通過促進角質形成細胞遷移加速創(chuàng)面上皮化而促進創(chuàng)面愈合，MMP-2在miR-155