耐冷及嗜鹽木聚糖酶的基因克隆、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及突變研究.pdf

1、半纖維素是除了纖維素以外最為豐富的多糖，也是自然界中的第二大可再生資源，所以人們對(duì)它的主要組成成分木聚糖的降解有著廣泛的興趣。降解木聚糖的最主要的糖苷水解酶是內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，它可以降解木聚糖主鏈的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生低聚寡糖和木糖。木聚糖酶在工業(yè)上，如飼料、造紙、食品、能源、紡織等方面的應(yīng)用都已經(jīng)非常的廣泛。為了滿(mǎn)足不同的工業(yè)需求，發(fā)掘和研究具有不同嗜極性質(zhì)（嗜堿、嗜酸、嗜冷、嗜鹽、嗜熱等等）的木聚糖酶顯得尤為重要。

2、r>　　本研究從一株來(lái)自海洋沉積物中的深海王祖農(nóng)菌Zunongwangia profunda中，利用特異性引物克隆了一木聚糖酶基因xynA，并成功的將其在大腸桿菌E.coli(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化后進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的分析。同時(shí)針對(duì)該木聚糖酶的特點(diǎn)，利用隨機(jī)突變技術(shù)進(jìn)行了定向進(jìn)化改造。所取得的研究進(jìn)展如下:
　　1.利用PCR技術(shù)從Zunongwangia profunda克隆得到的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因xynA全長(zhǎng)

3、1125bp，共編碼374個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小是43.7kDa。XynA的等電點(diǎn)pI是6.632，GC含量是38.81％。經(jīng)預(yù)測(cè)該木聚糖酶沒(méi)有信號(hào)肽。通過(guò)BLAST比對(duì)，XynA屬于糖苷水解酶第10家族，催化氨基酸殘基是Glu169和Glu276。在已報(bào)道的木聚糖酶中，XynA最高相似性為42.78％。將XynA在大腸桿菌E.coli(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化后分析木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。XynA的最適pH是6.5，最適溫度30℃，在

4、0℃和5℃的低溫仍分別可以保持15％和32％的活性。XynA不僅僅是一個(gè)冷活性的木聚糖酶，而且是一個(gè)耐鹽的木聚糖酶。NaCl可以大大的提高酶的活性并增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。XynA的最適鹽濃度是3.0mol/L NaCl，表現(xiàn)出最大激活活性191％，而且在5.0mol/L NaCl時(shí)，仍可以保持100％的活性。以1.0％山毛櫸木聚糖為底物時(shí)，在有3.0mol/L NaCl存在時(shí)，XynA的Vmax、Km、kcat、kcat/Km分別由無(wú)NaC

5、l存在時(shí)的0.05291mg/mL/min、2.98mg/mL、47.26/s、15.87mL/mg/s變成了0.03459mg/mL/min、1.15mg/mL、80.33/s、69.91mL/mg/s。在熱穩(wěn)定性方面，與沒(méi)有NaCl存在時(shí)相比，3.0mol/L的NaCl使XynA在45℃孵育1h后的活性由8％提升到了55％，大大增強(qiáng)了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。這可能是第一個(gè)報(bào)道的在如此高濃度(3.0mol/L-5.0mol/L)的NaCl

6、還可保持高活性的耐冷木聚糖酶。這一性質(zhì)使得該木聚糖酶在食品以及從海藻中生產(chǎn)生物乙醇等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.針對(duì)木聚糖酶XynA高耐鹽性這一特點(diǎn)，欲使其該特點(diǎn)更加的突出，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建了隨機(jī)突變庫(kù)，并針對(duì)性的在篩選底物中添加3.5mol/L的NaCl。從約7000個(gè)突變體中成功的篩選到一株突變體XynA-JD27，氨基酸序列比較后發(fā)現(xiàn)，在其C末端比野生型的少了27個(gè)氨基酸。突變株的最適pH仍是6.5，與野生型的一

7、樣。但是最適溫度降到了25℃，并且在5℃可以保持50％的活性，而在稍高的溫度條件下的活性沒(méi)有野生型的高。最適鹽濃度提升到3.5mol/L NaCl，并且在1.0mol/L-5.0mol/L NaCl范圍內(nèi)都可保持148％以上的活性，較野生型的鹽激活作用有了很大的提高。在以1％的山毛櫸為底物時(shí)，XynA-JD27的Vmax、Km、kcat和kcat/Km分別是0.08288mg/mL/min、3.86mg/mL、69.92/s和18.11