復合功能型酸敏納米藥物運載體系的制備及性質研究.pdf

1、在腫瘤化療中，發(fā)展和完善安全高效的藥物轉運系統(tǒng)和技術是促進藥物臨床應用的關鍵。現(xiàn)階段的抗腫瘤藥物通常有極高的生物毒性且缺少特異選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會影響到正常組織細胞。作為理想的藥物轉運系統(tǒng)，它必須具有較長的體內循環(huán)時間和適宜的穩(wěn)定性，能夠保護藥物在正常組織的轉運過程中不提前滲漏或失活；能夠靶向特異的病灶部位并在外部刺激的作用下釋放藥物。為了實現(xiàn)這一想法，許多藥物轉運系統(tǒng)被賦予了一定的功能特性，如pH敏感脂質體、膠束、引入靶

2、向基團的聚合物納米粒及聚合物前藥等。其中，pH響應的多功能聚合物納米粒備受關注。腫瘤細胞由于糖的無氧酵解旺盛產生大量乳酸，使其細胞內pH值低于正常細胞，相差約0.7pH。腫瘤細胞外pH在6.5-7.2之間，細胞內的內涵體和溶酶體則酸性更強，分別在5.0-6.5之間和4.5-5.0之間。正常組織的pH為一個恒定值7.4。這種pH的顯著性差異可作為實體瘤治療的突破口。因此，結合納米載體本身具有的被動靶向特性及表面修飾靶向分子后具有的主動靶向

3、特性，pH響應型釋藥的靶向納米藥物載體可以更進一步提高載體對腫瘤部位的選擇性、提高藥物對病灶部位的治療效率，減少藥物的毒副作用。
　　本論文是在pH響應型的功能性抗腫瘤納米藥物載體的大背景下展開的。課題研究分別從酸敏載體和酸敏化學鍵入手，構建了三種不同類型的pH響應型納米藥物載體。第一部分的研究工作是從酸敏載體的角度出發(fā)，系統(tǒng)的對比了三種磺胺二甲氧嘧啶衍生物與葡聚糖反應后形成的納米載體的理化性質，篩選得到一組具有pH敏感特性的納米

4、體系。研究中對三種納米體系各自的自組裝成粒機理過程進行了探討。第二部分研究工作則從酸敏化學鍵的角度出發(fā)，將聚合物藥物進一步制備成納米粒的形式，并同時包封其他疏水性的藥物，共同發(fā)揮作用。但是研究中我們發(fā)現(xiàn)，該納米載體不可避免的會感應腫瘤細胞外pH釋藥。且胞外釋放的藥物有可能重新擴散分布到正常組織，降低藥物的靶向特異性。因此，在前面這兩部分工作的基礎上，第三部分的研究工作中我們采用酸敏載體和酸敏化學鍵相結合的策略，針對腫瘤耐藥細胞，構建了一

5、組新型復合功能的pH響應型藥物載體，并以一種新穎且簡單的方法引入并保護穿膜肽。與文獻報道的繁瑣的屏蔽-去屏蔽保護方法相比，更具有可行性。分別考察了納米藥物載體的形態(tài)、粒徑、表面電荷，臨界膠束濃度等理化性質及酸敏特性，并進行了初步的體外抗腫瘤活性研究。具體內容如下：
　　第一部分馬來?；暇厶?磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/SD）納米載體的制備及其性質研究
　　以葡聚糖和酸敏材料磺胺二甲氧嘧啶為主要原料，首先合成出三種葡聚糖/

6、磺胺二甲氧嘧啶的系列衍生聚合物：馬來?；暇厶?磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/SD），馬來?；暇厶?聚磺胺二甲氧嘧啶（Dex-MA/PSD）和葡聚糖/羧基化磺胺二甲氧嘧啶（Dex/COOH-OSDM）。通過調節(jié)親水鏈段和疏水鏈段的比例，篩選出當Dex-MA/SD體系中Dex-MA:SD為1:3（w/w），Dex-MA/PSD體系中Dex-MA:PSD為2:3（w/w），Dex/COOH-OSDM體系中Dex:COOH-OSDM為4:3

7、（w/w）時，由透射電鏡觀察制備的納米粒粒徑均勻（100nm左右），分散性較好。實驗中系統(tǒng)對比了SD、PSD及COOH-OSDM與改性葡聚糖或葡聚糖反應后形成的三種納米體系的理化性質，并選擇在pH7.4的去離子水中透析成納米粒，形成了一種與之前文獻報道的不同的納米粒結構。芘熒光法測定的Dex-MA/SD，Dex-MA/PSD和Dex/COOH-OSDM的臨界聚集濃度分別是3.0μg/mL，4.9μg/mL，5.2μg/mL。臨界聚集濃度

8、越小，表明該體系就越穩(wěn)定。自組裝成粒后，三者的zeta電位分別是-47.1mV，-28.3mV，-8.18mV。在隨后的粒徑和zeta電位隨pH變化的研究中，只有Dex-MA/SD納米體系表現(xiàn)出了pH敏感性，另兩組則沒有。由此，根據(jù)三種納米體系的結構特點對三種納米體系成粒機理進行了探討。結果表明：Dex-MA/SD納米體系因其表面帶有部分的SD基團具有更靈敏的酸敏特性，優(yōu)于后兩組。pH7.4時，Dex-MA/SD粒徑為92nm。pH6.

9、8時，其粒徑迅速增大到222nm。體外模擬釋藥性質的研究中，選用阿霉素為藥物模型。Dex-MA/SD納米粒在pH7.4，pH7.0，pH6.8，pH6.0的介質中釋藥2h后，其藥物累積釋放率分別是6.0％，13.2％，20.0％，24.0％。隨著pH的依次減小，相同時間內藥物累積釋放率依次增大。pH6.0時，20h內藥物累積釋藥率接近75％。在體外腫瘤細胞內攝作用的研究中，pH6.0，pH6.8時，細胞內阿霉素的熒光強度明顯高于pH7.

10、4時的熒光強度。表明在Dex-MA/SD納米粒的作用下，pH6.0，pH6.8時阿霉素進入細胞的量要多于pH7.4的情況，這也是和體外模擬釋藥實驗的結果相吻合的。這些結果表明Dex-MA/SD納米載體具有顯著的pH敏感釋藥特性，可有望成為一種pH響應釋藥的抗腫瘤藥物載體。
　　第二部分共轉運阿霉素（Dox）和吡咯烷硫氨甲酸銨（PDTC）的葉酸-普魯蘭多糖-阿霉素（FA-MP-Dox）聚合物納米載體的制備及其性質研究
　　克服

11、腫瘤多藥耐藥是癌癥化療中的一個瓶頸問題，如何克服外排蛋白作用，提高藥物在腫瘤細胞內的濃度成為解決腫瘤耐藥性的關鍵問題。經特異性配體修飾的納米粒具有主動尋靶的特性，可以在一定程度上緩解腫瘤細胞耐藥性的影響。此外，當NF-κB抑制劑與化療藥物聯(lián)合應用時，NF-κB抑制劑可增強放化療的治療效果，亦能達到降低耐藥性的效果。但是現(xiàn)階段的藥物輸送體系亟需解決的問題是載藥能力太低。如在納米顆粒載體或脂質體內，載藥量一般不超過10％。因此在本部分實驗中

12、，利用酸敏連接臂酰胺鍵將藥物阿霉素鍵合到葉酸-普魯蘭多糖的聚合物鏈上，將FA-MP-Dox聚合物藥物進一步制備得到聚合物納米粒，并同時包封抗腫瘤藥物Dox和目前最有效的NF-κB活性抑制劑PDTC，得到FA-MP-Dox/PDTC+Dox納米體系。通過化學鍵合和包封相結合的方法提高體系的載藥率。其中FA-MP-Dox聚合物中阿霉素和葉酸的含量為7.5wt％，2.0wt％。納米粒粒徑在152nm左右，形態(tài)圓整。兩種藥物的釋放呈現(xiàn)出較強的p

13、H依賴性。30h后，pH5.0和pH7.4時，阿霉素的藥物累積釋藥率分別達到53％和26％。這是由于在pH5.0時部分酰胺鍵發(fā)生酸解斷鍵，F(xiàn)A-MP-Dox體系中鍵合的阿霉素逐漸被釋放出來，造成納米粒結構逐步解離。在此時的酸性環(huán)境中，游離的阿霉素帶有正電荷，藥物分子間產生靜電斥力，從而加速釋放出包封的藥物。以阿霉素敏感的A2780細胞和耐藥的A2780/DOXR為體外腫瘤細胞模型，分別研究了不同納米體系的細胞毒性和內攝作用。對于耐藥A2

14、780/DOXR，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的細胞毒性（IC50為9.8μM）比MP-Dox/PDTC+Dox（IC50為20μM）的細胞毒性顯著增強。阿霉素由于細胞耐藥性的存在，細胞毒性相對較弱。因此受體介導的納米粒一定程度上緩解了腫瘤細胞的耐藥性的影響。此外，對于A2780細胞來說，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的細胞毒性（IC50=2.0μM）同樣高于MP-Dox/PDTC+Dox（IC50=7.5μM

15、）。但是此時FA-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒卻沒有阿霉素（IC50=0.17μM）的細胞毒性強。在內攝作用研究中，對于A2780/DoxR來說，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC+Dox納米粒的入胞程度遠高于MP-Dox/PDTC+Dox納米粒或游離Dox，且主要分布在細胞核和細胞質中。沒有包封PDTC的FA-MP-Dox/Dox納米粒中釋放的阿霉素在細胞膜周圍分布的較少，從而證實除葉酸分子的靶向作用外，F(xiàn)A-MP-Dox/PDTC

16、+Dox納米體系在PDTC的協(xié)同作用下，進一步提高了阿霉素在腫瘤細胞內的濃度，在一定程度上克服了腫瘤細胞的耐藥性。
　　第三部分包載Dox-TAT的促黃體生成素釋放激素-聚乙二醇-聚組氨酸-阿霉素（LHRH-PEG-PHIS-Dox）納米載體的制備及其性質研究
　　研究中我們發(fā)現(xiàn)，即使采用共轉運耐藥逆轉劑和化療藥物的方法來對抗多藥耐藥性，納米載體仍不可避免的在胞外釋藥，降低藥物的靶向特異性。因此，生物活性分子的細胞內轉運仍是

17、藥物轉運的一個關鍵問題。穿膜肽（如TAT）具有細胞膜親和性高、穿膜速度快、降解迅速等優(yōu)勢，可直接帶領大分子或藥物穿過細胞膜，尤其是對于耐藥細胞同樣有效?；谶@一點，本實驗中選用更為適合的酸敏材料，采用酸敏載體和酸敏化學鍵相結合的策略，制備了LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT載藥膠束。芘熒光法測定LHRH-PEG-PHIS-Dox的臨界膠束濃度為4.9μg/mL，表明該體系具有較好的穩(wěn)定性。當pH從8.0減小到5.0的時候

18、，粒徑從78nm迅速增大到158nm，粒徑隨pH的減小而增大。在體外模擬釋藥性質的研究中，20h后，在pH6.8的釋放介質中，LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT的累積釋藥率為67％，而在pH7.4的環(huán)境下，藥物累積釋放率還不到19％。這是因為在pH<7.0時，膠束溶脹，粒徑變大，利于藥物的滲透釋放，另外此時膠束自身帶有了部分正電，與正電性的Dox-TAT間產生靜電斥力，從而也可加速藥物的釋放。粒徑、zeta電位和體外模擬

19、釋藥實驗結果證實LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT具有靈敏的pH響應特性。在細胞毒性的研究中，包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系在pH6.8時的細胞毒性強于包封Dox的LHRH-PEG-PHIS-Dox和LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系。流式細胞儀分析和內攝作用研究的結果亦表明：pH6.8時，包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox納米體系入胞后的熒光強度相對最高，且在

20、細胞核和細胞質中均有分布。這說明釋放的Dox-TAT在TAT的作用下，可避開耐藥性的影響，快速進入細胞。綜上所述，在這個體系中，阿霉素以酸敏連接臂酰胺鍵鍵合到PHIS的鏈端，既增強了膠束的穩(wěn)定性，同時又提高了載藥率。并且利用聚組氨酸不同pH時的溶解性差異，有效控制Dox-TAT藥物的釋放，以一種新穎且簡單易行的方法保護了TAT。LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT綜合了超酸敏材料聚組氨酸和穿膜肽TAT的優(yōu)良特性，可有望成為