中國不同地區(qū)A、B組輪狀病毒分離株VP7基因序列的比較分析.pdf

1、目的： 研究從我國大慶地區(qū)嬰幼兒腹瀉臨床糞便標本中分離的一株A組人輪狀病毒陽性毒株(命名為DQ-1株)VP7基因的基因分型，對DQ-1株VP7基因序列和糖蛋白VP7的蛋白質結構進行分析，并與已測序同血清型標準株和國內外地方株VP7基因序列進行序列比對。 方法： 通過RT-PCR技術擴增人A組輪狀病毒DQ-1株VP7全長基因，并將RT-PCR)產物連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，在含有氨

2、芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落后挑取白色菌落進行檢測，從中篩選出兩個PCR陽性菌落，并提取質粒，雙酶切鑒定，最后利用通用引物進行測序。利用DNAStar軟件對DQ-1株VP7基因測序序列與其他A組輪狀病毒株VP7基因序列進行同源性比較；用RNAstructure4.4軟件繪制DQ-1株VP7基因的二級結構；用Predictprotein軟件對DQ-1株糖蛋白VP7蛋白結構進行分析。 結果： DQ-1株VP7基

3、因與同型的我國已測序G1型地方株T73、R96-197株基因序列同源性均為97.6﹪，與G1型標準株Wa株核苷酸序列同源性為92.9﹪，與G2血清型代表株DS-1株基因序列同源性為73.8﹪，與G3血清型代表株SA11株核甘酸序列同源性為75.6﹪，與G4血清型代表株J-4621株(78.1﹪)同源性也不高；其VP7基因mRNA可折疊多達20個發(fā)卡結構。DQ-1株VP7蛋白是由354個氨基酸組成的多肽，含有2個潛在的糖基化位點和多個磷酰

4、化位點；DQ-1株氨基酸序列與T73、R96-197株同源性都達97.5﹪，與wa株達94.6﹪，而與其它型DS-1株、SAll株和J-4621株分別僅為74.4﹪、79.4﹪和75.2﹪。因此，我們推定DQ-1株屬于Gl血清型。 結論： DQ-1株VP7基因序列與已測序我國G1型地方株VP7基因序列幾乎沒有差別，而與Gl型標準株VP7基因序列存在細微差異，這為我國人A組輪狀病毒疫苗的引進和研制提供了分子生物學依據。

5、 目的： 克隆中國不同地區(qū)四個B組成人腹瀉輪狀病毒株結構蛋白VP7基因，通過測序得到其核苷酸序列和氨基酸序列，比較與其它B組輪狀病毒毒株基因和氨基酸序列同源性，從而進一步分析我國不同地區(qū)流行的B組成人腹瀉輪狀病毒毒株之間的系統(tǒng)進化關系。 方法： 參照文獻設計引物，對中國不同地區(qū)流行的4株B組輪狀病毒株進行RT-PCR，并將RT-PCR產物克隆到PCR Ⅱ載體，轉化E．Coli感受態(tài)細胞，提取轉化菌質粒

6、經限制性內切酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切分析，從中篩選陽性重組質粒進行測序，測序結果采用DNAStar6.0進行多重序列比對分析，并與B組輪狀病毒代表株和其它已測序地方株的核苷酸及氨基酸序列進行同源性比較，繪制系統(tǒng)遺傳進化樹。 結果： 本研究獲得的4株B組成人腹瀉輪狀病毒株核苷酸序列同源性為97.3﹪～98.8﹪，氨基酸序列同源性為95.2﹪～99.3﹪之間；與B組成人腹瀉輪狀病毒代表株ADRV核苷酸序列同源性為98

7、.2﹪～100﹪，氨基酸序列同源性為97.4﹪～100﹪；與國外B組成人腹瀉輪狀病毒株印度、孟加拉國株核苷酸序列同源性為90.1﹪～92.5﹪，氨基酸序列同源性為92．3﹪～95．6﹪。 結論： 研究表明所有B組成人腹瀉輪狀病毒毒株均屬于同一血清型，這為成人腹瀉輪狀病毒的流行病學監(jiān)測以及將來研制成人腹瀉輪狀病毒疫苗提供了分子生物學依據，同時本研究可以從分子病毒學理論上證明“病毒是以居群的形式存在的”和“病毒的居群內部存在