野生型p53基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗肺癌效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、研究背景與目的： 肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率仍將在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)。目前，治療肺癌的主要手段是以外科手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療，但大部分患者在就診時(shí)己經(jīng)失去手術(shù)時(shí)機(jī)；放療、化療成為唯一的手段。然而，由于肺癌原發(fā)與獲得性的耐藥常見(jiàn)，通常療效差，預(yù)后不好。放、化療不僅能殺死腫瘤細(xì)胞，也能損傷正常細(xì)胞，特別是對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成了抑制效應(yīng)。腫瘤免疫治療正是通過(guò)激活腫瘤患者自身的對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，

2、在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的危害較輕或無(wú)損害，故己成為當(dāng)今腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。樹(shù)突狀細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的專職抗原遞呈細(xì)胞。荷載抗原的DC具有疫苗的功能，故稱之為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在多種腫瘤中進(jìn)行。選擇合適的腫瘤相關(guān)抗原對(duì)DC進(jìn)行基因修飾，從而提高DC對(duì)腫瘤抗原的遞呈能力，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤特異抗原的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而殺滅腫瘤細(xì)胞，是DC疫苗研究的一個(gè)重要內(nèi)容。p53基因是一種抑癌基因，

3、許多研究表明腫瘤發(fā)生與p53基因失活或發(fā)生變異有關(guān)，大多數(shù)肺癌的細(xì)胞表現(xiàn)為突變p53蛋白的過(guò)表達(dá)，因此p53蛋白提供了一個(gè)具有共性的肺腫瘤特異性抗原的靶點(diǎn)。 本研究采用商品化的攜載野生型p53基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞，使之成為負(fù)載p53抗原的DC，探討p53-DC誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞在肺癌免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值及可行性，同時(shí)觀察體內(nèi)和體外腫瘤細(xì)胞對(duì)DC成熟度的影響以及中藥葫蘆素B對(duì)DC成

4、熟的調(diào)節(jié)作用及其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫治療反應(yīng)性的影響，以期為DC疫苗的臨床應(yīng)用提供新的方法和理論依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 一、野生型p53基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)抗原特異性CTL抗肺癌的免疫治療效應(yīng) 1、體外DC培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化經(jīng)血細(xì)胞分離儀分離健康人外周血白細(xì)胞，以人重組細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α和PGE2誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增與分化，用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其表面DC標(biāo)志分子，同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DC

5、刺激T細(xì)胞增殖能力。 2、p53-DC的制備與p53抗原特異性CTL的體外誘導(dǎo)采納“今又生”(商品化野生型p53腺病毒載體，Ad-p53)感染體外培養(yǎng)DC，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)感染48小時(shí)后DC細(xì)胞p53表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)后DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)變化。將p53-DC與同來(lái)源的外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生p53抗原特異性CTL，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后淋巴細(xì)胞表型及表達(dá)干擾素-γ/白介素-4 T淋巴細(xì)胞的百分比改

6、變：液相芯片方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平；ELISPOT、法檢測(cè)p53抗原特異性CTL的誘導(dǎo)，以及CCK-8法檢測(cè)p53-DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)p53基因突變腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。 3、p53-DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)p53基因突變肺癌荷瘤裸鼠的治療作用分別在荷瘤裸鼠成瘤后第一周和第二周瘤旁皮下接種p53-DC誘導(dǎo)的CTL治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和裸鼠生存時(shí)間。 二、肺癌患者體內(nèi)未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC的分布與腫瘤細(xì)胞對(duì)

7、體外培養(yǎng)DC成熟分化的影響，及其葫蘆素B體內(nèi)外干預(yù)對(duì)DC成熟分化和p53-DC介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞免疫殺傷反應(yīng)性的信號(hào)調(diào)節(jié)作用 1、肺癌患者與正常對(duì)照者外周血未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC的分布比較. 2、16HBE/BPDE肺癌細(xì)胞對(duì)DC成熟分化的影響，及其葫蘆素B對(duì)p53一DC誘導(dǎo)的CTL殺傷16HBE/BPDE肺癌細(xì)胞的免疫增強(qiáng)作用和信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制將DC分別與16HBE、16HBE/BPDE共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)觀察肺癌細(xì)胞(16H

8、BE/BPDE)對(duì)DC表達(dá)成熟DC表面標(biāo)志分子的影響，以及葫蘆素B對(duì)DC成熟的誘導(dǎo)作用；用CCK-8法檢測(cè)葫蘆素B對(duì)DC和p53-DC誘導(dǎo)的CTL殺傷16HBE/BPDE作用的影響。Western blot檢測(cè)16HBE/BPDE肺癌細(xì)胞基態(tài)下磷酸化JAK2和STAT3的表達(dá)水平及其葫蘆素B的影響。 3、肺癌患者口服葫蘆素B，觀察用藥前后外周血未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC分布的變化。 結(jié)果： 一、野生型p53基因修飾

9、的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)抗原特異性CTL抗肺癌的免疫治療效應(yīng)用細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α和PGE2培養(yǎng)8天能成功地誘導(dǎo)成熟DC，顯微鏡下DC表面可見(jiàn)大量突起，并且成熟DC對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞的刺激作用顯著強(qiáng)于未成熟DC。 以MOI為20000的Ad-p53感染DC后，細(xì)胞存活率可達(dá)90.6±5.3％，表達(dá)p53蛋白的DC細(xì)胞占60％；與p53-DC和對(duì)照DC共培養(yǎng)10天的淋巴細(xì)胞中CD8<'+>T淋巴細(xì)胞比率均高于單獨(dú)

10、培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中CD8<'+>T細(xì)胞的比率(P均為0.000)，CD8<'+>T/CD4<'+>T大于1，但兩種DC活化的淋巴細(xì)胞表型無(wú)顯著性差異。然而與p53-DC共培養(yǎng)的CD8<'+>T淋巴細(xì)胞中分泌INF-γ的細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照DC組(44.63±2.15％比32.40±2.60％，P=0.002)，分泌IL-4的細(xì)胞比率與對(duì)照DC組比無(wú)顯著性差異(4.07±0.15％比3.73±0.57％，P=0.312)；p53-DC共培養(yǎng)

11、淋巴細(xì)胞上清中細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α含量分別為：2968.64±168.89 pg/ml和3486.12±263.49 pg/ml，顯著高于對(duì)照DC組：448.37±32.12 pg/ml和1978.87±163.34 pg/ml(P值均為0.000)：p53-DC組細(xì)胞因子IL-4和IL-10的含量是101.45±23.36pg/ml和915.64±68.47pg/ml，DC組的含量是124.66±18.17 pg/ml和85

12、6.49±39.73 pg/ml，兩組間無(wú)顯著差異(P分別為0.242和0.264)。與p53-DC共培養(yǎng)10天的淋巴細(xì)胞，再次接受p53-DC刺激時(shí)，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)是448±32/1×10<'5>，顯著高于對(duì)照DC組(264±20/1×10<'5>)，P=0.000。在不同效靶比，p53-DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)p53突變的肺癌細(xì)胞H460/cDDP的殺傷率，均明顯高于對(duì)照DC誘導(dǎo)的CTL的殺傷率 (P值分別為0.006，0.007

13、和0.001)。較之PBS處理組，經(jīng)p53-DC或?qū)φ誅C誘導(dǎo)的CTL治療后，荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，生存期延長(zhǎng)：p53-DC誘導(dǎo)的CTL治療組荷瘤裸鼠生存期較對(duì)照DC組顯著延長(zhǎng)；腫瘤體積顯著小于對(duì)照DC組。 二、肺癌患者體內(nèi)未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC的分布，以及肺癌細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)DC成熟分化的影響，及其葫蘆素B體內(nèi)外干預(yù)對(duì)DC成熟分化和p53-DC介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞免疫殺傷作用的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。 肺癌患者外周血未成熟髓系細(xì)

14、胞 (Lin<'->CD33<'+>HLA-DR<'->)和髓系DC(Lin<'->CD33<'+>HLA-DR<'+>)占單核細(xì)胞比率分別為：1.70±0.02％和0.72±0.15％，正常對(duì)照者外周血未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC比率分別為0.43±0.10％和2.28±0.23％，肺癌患者與正常對(duì)照者成熟與未成熟DC間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)。與肺癌細(xì)胞16HBE/BPDE共培養(yǎng)的健康者來(lái)源的DC，其表達(dá)成熟DC表面標(biāo)

15、志分子CD80，CD83及HLA-DR的細(xì)胞比率(1.76±0.3896，9.24±1.6996和30.76±4.85％)顯著低于與正常氣道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的DC(3.78±0.8696，13.64±2.3796和45.37±6.18％)， P值分別為0.000、0.035和0.018。經(jīng)葫蘆素B處理后，表達(dá)CD80，CD83，CD86及HLA-DR的細(xì)胞比率較未用葫蘆素B處理16HBE/BPDE組顯著增加，分別為4.78±1.0396，

16、8.67±4.06％，80.54±6.6696，40.72±3.64％。比較口服葫蘆素B肺癌患者治療前后未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC分布變化發(fā)現(xiàn)：未成熟髓系細(xì)胞和髓系DC分別為治療前的1.66±0.2396和0.58±0.0896，轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熀蟮?.77±0.14％和1.10±0.22％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.005和0.022)。進(jìn)一步的離體實(shí)驗(yàn)表明：?jiǎn)斡胮53-DC誘導(dǎo)的CTL并不顯示對(duì)具有p53基因突變低分化肺鱗癌細(xì)胞株1

17、6HBE/BPDE有特異性的殺傷效應(yīng)，應(yīng)用葫蘆素B預(yù)處理16HBE/BPDE 12小時(shí)，顯著提高了p53抗原特異性CTL對(duì)16HBE/BPDE的特異性殺傷作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明葫蘆素B能夠抑制16HBE/BPDE細(xì)胞磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達(dá)。 結(jié)論： 1、用人外周血單個(gè)核細(xì)胞，成功誘導(dǎo)分化、制備出大量可用于免疫治療的成熟DC。 2、Ad-p53感染的DC能夠誘導(dǎo)出p53抗原特異