利用重組工程技術(shù)構(gòu)建多價(jià)DNA疫苗載體及大腸桿菌活菌疫苗載體的分析比較.pdf

1、疾病預(yù)防的有效途徑之一是接種疫苗,繼第一代減毒或無(wú)毒疫苗和第二代亞單位疫苗之后出現(xiàn)了第三代DNA疫苗。疫苗效果在很大程度上依賴于輸送抗原的載體。為研究更有效的疫苗載體形式,本研究應(yīng)用噬菌體Red重組酶介導(dǎo)的新型重組工程技術(shù),構(gòu)建了多價(jià)DNA疫苗載體前體及攜帶禽流感病毒抗原基因的多價(jià)DNA疫苗載體,為了更好的輸送多價(jià)DNA疫苗,探索構(gòu)建了具有哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞黏附能力的無(wú)毒性重組大腸桿菌活菌疫苗菌株。
　　 在本室前期工作基礎(chǔ)上,本

2、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用如下Red重組工程系統(tǒng)及技術(shù):①大腸桿菌染色體上Red重組系統(tǒng)及kan-sacB選擇反選擇篩選方法②pKD46重組系統(tǒng)及kan-kil選擇反選擇篩選方法③pYM-Red重組系統(tǒng)及Gap-Repair缺口修復(fù)技術(shù),進(jìn)行染色體上基因的無(wú)痕敲入、替換及質(zhì)粒構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)解決基因融合打靶問(wèn)題時(shí),在重組技術(shù)上有創(chuàng)新應(yīng)用,利用Red重組酶工作原理,將外源片段體外重疊PCR法制備改為片段體內(nèi)重組融合,片段融合及重組均在體內(nèi)完成,省略了體外PCR

3、的步驟加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。
　　 以pcDNA3.1(-)B為基礎(chǔ),以酶切連接方法構(gòu)建了四價(jià)DNA疫苗載體pWYⅠ-Ⅱ-Ⅲ-Ⅳ,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明其具有蛋白表達(dá)能力,真核表達(dá)的多價(jià)DNA疫苗載體構(gòu)建成功,可用于攜帶多價(jià)抗原基因,避免了多質(zhì)粒操作帶來(lái)的不便。然后利用重組技術(shù)試圖將禽流感病毒基因組抗原基因HA頭部、NA全長(zhǎng)分別加載到其Ⅰ、Ⅱ位,構(gòu)建二價(jià)DNA疫苗。
　　 將南美錐蟲(chóng)(trypanosome cruzi)gp82基因的

4、P4及P8 DNA區(qū)段融合構(gòu)建成P4/8基因片段,將其敲入大腸桿菌染色體的外膜蛋白LamB基因內(nèi)形成融合蛋白,并展示在細(xì)胞外膜上,構(gòu)建出帶有細(xì)胞黏附能力的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株。通過(guò)體外黏附實(shí)驗(yàn)證明,以前構(gòu)建的E.coli DY330 P4<>lamb比新構(gòu)建的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株黏附哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的能力要強(qiáng)；同時(shí)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明DY330.P4<>lamb菌株安全性良好,

5、可做為活菌疫苗載體的候選株進(jìn)行深入研究。
　　 研究表明,重組工程技術(shù)在構(gòu)建多種形式疫苗載體中具有靈活性及有效性,構(gòu)建的多價(jià)DNA疫苗載體具備通用性,可以加載多種抗原基因的組合,作為快速制備疫苗的模板,有效應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情；構(gòu)建的黏附性活菌疫苗載體可以攜帶DNA疫苗,也可以直接在染色體上攜帶抗原基因,高效運(yùn)送抗原基因或蛋白。在應(yīng)用中不斷嘗試各種構(gòu)建方案也使我們更深入理解了重組酶工作原理,希望通過(guò)技術(shù)的拓展加速疫苗的研制與開(kāi)發(fā)進(jìn)程,為