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文檔簡介
1、目的:本研究分體內(nèi)和體外兩部分,探討重組人生長激素(recombinanthumangrowthhormone,rhGH)對MSCs的促進作用,觀察rhGH與MSCs聯(lián)合治療阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的療效,并對其可能的機制進行分析,旨在尋找一種既可提高移植MSCs存活率,又不會對機體產(chǎn)生不利影響的藥物,為MSCs臨床治療DCM所致心力衰竭提供理論依據(jù)。 方法: 1.阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型的制作 采用阿霉
2、素腹腔注射的方法(每次2.5mg/kg,3次/周,用1周,間隔2周,再用1周,共計6次,總劑量15mg/kg。末次注射完成后觀察4周。)制作阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型。通過心臟彩色多普勒超聲測定左室舒張末內(nèi)徑(LVDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LNSD)、左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS);經(jīng)右頸總動脈插管入左心室,測定左心室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓力最大上升速率(dp/dtmax)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)
3、及左室內(nèi)壓力最大下降速率(-dp/dtmax);留取心臟標本,測定全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)及左室質(zhì)量指數(shù)(LW/BW),并觀察心腔大?。涣羧∽笮氖覙吮拘蠬E染色觀察病理變化,鑒定模型制作是否成功。 2.骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的體外分離、培養(yǎng)、鑒定、誘導分化、標記和超微結(jié)構的變化 選7周齡,體重約160-170g左右的Wistar大鼠,采集其雙側(cè)股骨、脛骨的骨髓,使用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞;觀察其生長
4、特性,待細胞傳至第3代時,采用流式細胞儀進行細胞表面抗原CD44、CD45和CD71的測定;取第3代MSCs加入10μmol/l的5-氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)孵育24h進行誘導,分別在誘導后2、3、4周時應用免疫組織化學的方法測定橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomericactin)和肌球蛋白重鏈(MHC)的表達,觀察MSCs經(jīng)5-Aza誘導轉(zhuǎn)化為心肌細胞的情況;并采用流式細胞儀測定MSCs轉(zhuǎn)化為心肌細胞的轉(zhuǎn)化率;
5、同時收集未經(jīng)5-Aza誘導、5-Aza誘導后2、3、4周時的MSCs,制作標本行電鏡檢查,通過以上方法鑒定體外培養(yǎng)的細胞是否為骨髓間充質(zhì)干細胞。移植前,在體外培養(yǎng)的MSCs中加入10mg/l的5-溴脫氧脲嘧啶(BrdU)孵育24h進行細胞標記,用于MSCs進入體內(nèi)的跟蹤。 3.重組人生長激素(rhGH)在體外對MSCs的作用及其機制研究 取生長良好的第2代MSCs細胞,采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MMT法)測定不
6、同終濃度(1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml和500ng/ml)rhGH作用時MSCs的生長率(或抑制率);取最佳作用濃度(200ng/ml)的rhGH加入MSCs中,作用不同時間(24、48、72h)MMT法測定MSCs的生長率(或抑制率);采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法測定rhGH作用不同時間(24、48、72h)及去除rhGH作用后不同時間(4d、9d、10d、2周、3周
7、和4周)時,胰島素樣生長因子1(IGF-1)mRNA的表達,來判斷rhGH是否通過IGF-1介導促進MSCs生長。 4.rhGH、MSCs移植及rhGH聯(lián)合MSCs移植治療對阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的影響 將實驗動物隨機分為正常對照組(正常組)6只、心力衰竭對照組(HF組)9只、rhGH治療組(GH組)6只、MSCs移植治療組(MSCs組)7只和rhGH+MSCs移植聯(lián)合治療組(G+M組)7只。MSCs組和G+M
8、組動物通過心肌局部點狀注射(分4點)的方法將100μl(含細胞數(shù)約5×106個)MSCs移植入左心室心肌內(nèi),G+M組動物在MSCs移植前的3天加用rhGH(2mg/kg,隔日1次,皮下注射),MSCs組動物在細胞移植前的3天加用同體積生理鹽水皮下注射,隔日1次;GH組動物皮下注射rhGH(2mg/kg,隔日1次),同時行假手術向心肌內(nèi)注入等量生理鹽水;正常組和HF組動物行假手術向心肌內(nèi)注入等量生理鹽水的同時,皮下注射與rhGH同體積的生
9、理鹽水,隔日一次,共觀察1個月。治療前后留取靜脈血標本測定血清生長激素(GH)和腦利鈉肽(BNP)的濃度;治療1個月后,經(jīng)右頸總動脈插管入左心室,測定左心室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓力最大上升速率(dp/dtmax)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)及左室內(nèi)壓力最大下降速率(一dp/dtmax);留取心臟標本,測定全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)及左室質(zhì)量指數(shù)(LW/BW),左心室標本行病理及超微病理結(jié)構觀察。 5.rhGH與MSC
10、s聯(lián)合治療改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的機制研究 應用免疫組織化學的方法檢測體外BrdU標記的MSCs在心肌內(nèi)的存活和分布情況;采用免疫組織化學雙染的方法同時檢測BrdU(細胞核)和MHC(細胞漿)兩種抗原來觀察MSCs進入體內(nèi)是否分化為心肌細胞,及其在心肌內(nèi)的存活和分布情況;采用MercadierJJ等的方法提取大鼠心肌肌球蛋白,利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離肌球蛋白重鏈(MHC)同功酶V1型和
11、V3型,觀察其各自的變化和相互轉(zhuǎn)化情況;并采用RT-PCR法測定IGF-1mRNA的表達,綜合以上因素對rhGH與MSCs聯(lián)合治療改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠心功能的機制進行分析。 結(jié)論: 1.阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠模型的制作是成功的,且可視為DCM模型。 2.體外培養(yǎng)的細胞為MSCs,經(jīng)5-Aza誘導后可向心肌細胞轉(zhuǎn)化,其轉(zhuǎn)化率較低。 3.rhGH在體外可促進MSCs的生長,其促生長作用需要I
12、GF-1介導來完成。 4.rhGH治療可改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠的心臟收縮功能,MSCs移植治療未見明顯的改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠心功能的作用,二者聯(lián)合應用可很好地改善阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的心臟收縮和舒張功能。 5.rhGH聯(lián)合MSCs移植治療可很好地改善阿霉素性心肌病所致心力衰竭大鼠的心功能的機制為:①rhGH在體內(nèi)促進了MSCs的生長,增加了具有收縮功能的心肌細胞數(shù)量;②rhGH和MSCs移
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