多胺氧化酶在脫落酸誘導玉米葉片細胞溶質(zhì)抗氧化防護中的作用.pdf

1、植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)可以調(diào)節(jié)植物抗逆(包括干旱、冷害、鹽害等)的多種生理反應和分子生物學效應。過去的研究結(jié)果已經(jīng)表明ABA能夠誘導過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)產(chǎn)生以及抗氧化基因的表達，但有關(guān)ABA誘導植物抗氧化防護能力提高的詳細機制仍有許多問題尚不清楚。多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)是一種主要分布在禾谷類等單子葉植物中的胺氧化酶。它分子中含有黃素蛋白

2、(flavoprotein，F(xiàn)AD)，能將細胞產(chǎn)生的胺類物質(zhì)(如亞精胺和精胺)氧化成醛，并釋放NH3和H2O2。目前關(guān)于PAO的研究多集中于其在細胞壁硬化以及程序性細胞死亡中的作用，有關(guān)ABA誘導的H2O2產(chǎn)生中，PAO的貢獻及功能研究還非常少，特別是PAO對亞細胞區(qū)室細胞溶質(zhì)抗氧化防護系統(tǒng)的影響，目前尚未見報道。為此，本研究以玉米(Zea mays L.)葉片為材料，應用組織化學和細胞化學、酶活性分析以及半定量RT-PCR相結(jié)合的手段

3、，進一步研究玉米多胺氧化酶(maize polyamine oxidases，MPAO)是否參與ABA誘導的玉米葉片中H2O2產(chǎn)生及其在細胞溶質(zhì)抗氧化防護的作用。主要的研究結(jié)果如下： 采用半定量RT-PCR的方法，100μM ABA處理后，玉米葉片中MPAO基因轉(zhuǎn)錄水平與對照相比，在10 min至20 min時出現(xiàn)一個快速、瞬時的上調(diào)；另一方面，相對于對照組，質(zhì)外體MPAO活性在ABA處理后迅速上升，在0.5 h達到最大后開始下

4、降，即外源ABA處理能誘導其基因表達和酶活性的提高。 DAB在過氧化物酶催化下能與H2O2反應生成深棕色的多聚化合物。本研究用DAB染色檢測H2O2量的變化來揭示MPAO在外源ABA誘導H2O2產(chǎn)生中的作用。從組織化學圖片中可以看出，在外源ABA的處理下則迅速地引起了玉米葉片H2O2的大量積累。分別采取MPAO的兩種抑制劑，并結(jié)合ABA處理來觀察它們對外源ABA誘導玉米葉片H2O2積累的影響。結(jié)果表明不同濃度的兩種抑制劑(0.

5、1，0.5和1 mM)均對ABA誘導的玉米葉片H2O2的積累有一定抑制作用。 用細胞化學方法來進一步揭示MPAO在外源ABA誘導H2O2積累中的作用。電鏡照片表明，在外源ABA處理條件下，玉米葉肉細胞位于朝向細胞間隙的細胞壁上有大量的黑色沉積物，表明外源ABA誘導質(zhì)外體產(chǎn)生大量的H2O2。抑制劑實驗中，guazatine和DADD處理后葉肉細胞壁上的沉積物明顯減少，這與組織化學的結(jié)論是一致的。而抑制劑預處理8n后結(jié)合純水處理，未

6、發(fā)現(xiàn)在玉米葉肉細胞質(zhì)外體有H2O2的產(chǎn)生，表明抑制劑本身對于實驗結(jié)果沒有影響。MPAO酶活性結(jié)合半定量RT-PCR分析以及組織化學結(jié)合細胞化學方法的研究進一步提示，MPAO可能參與了ABA誘導的玉米葉片H2O2的產(chǎn)生，MPAO是玉米葉片中活性氧的來源之一。 研究表明，ABA上調(diào)了玉米葉片細胞溶質(zhì)抗氧化防護酶SOD，APX的活性。為了明確MPAO與玉米葉片細胞溶質(zhì)抗氧化防護的關(guān)系，本研究用MPAO抑制劑guazatine和DADD

7、預處理8h，再用100μM ABA處理8h或12 h來進行研究。結(jié)果表明這兩種抑制劑均部分抑制ABA誘導的抗氧化防護酶cAPX和SOD4基因的表達以及細胞溶質(zhì)APX和SOD活性的提高，并且抑制劑濃度越高抑制程度越明顯。這提示MPAO可能參與了ABA誘導玉米葉片細胞溶質(zhì)抗氧化防護系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。 為了進一步明確MPAO對玉米葉片細胞溶質(zhì)抗氧化防護系統(tǒng)的影響，用MPAO的最適底物(Spd，Spm)處理玉米離體植株。1 mM Spd處理引

8、起了細胞溶質(zhì)抗氧化防護能力的提高。外源多胺處理提高了離體玉米植株抗氧化防護基因cAPX和SOD4的表達，也提高了細胞溶質(zhì)抗氧化防護酶APX，SOD的活性。另一方面，MPAO抑制劑(guazatine、DADD)和H2O2清除劑(CAT、DMTU)的實驗結(jié)果表明抑制劑或清除劑均明顯抑制了多胺誘導的抗氧化防護酶cAPX和SOD4基因表達以及細胞溶質(zhì)APX和SOD活性的提高，并且抑制劑濃度越高抑制程度越明顯。這說明MPAO是通過分解多胺產(chǎn)生的