創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織NF-κB活性和促-抗炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)及抗菌藥物干預(yù).pdf

1、目的：探討創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織內(nèi)毒素受體CDl4的基因表達(dá)、NF-κB活性和促/抗炎細(xì)胞因子(TNF-α/IL-10)的基因表達(dá)以及抗菌藥物頭孢哌酮鈉聯(lián)用乳酸左旋氧氟沙星對(duì)其的干預(yù)效應(yīng). 方法： 1.清潔級(jí)雄性SD大鼠110只,隨機(jī)分11組,每組10只,第1組:正常對(duì)照組(NC組).第2～6組:創(chuàng)傷弧菌膿毒癥組(VV組),予雙后肢皮下注射創(chuàng)傷弧菌(濃度為9×10<'8>cfu/ml,劑量為1m1/100g),構(gòu)建創(chuàng)傷

2、弧菌膿毒癥模型.該組大鼠分別在注射創(chuàng)傷弧菌后2h、6h、9h、12h、16h時(shí)活殺,各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物數(shù)均為10只.第7～11組:創(chuàng)傷弧菌膿毒癥聯(lián)用抗菌藥物干預(yù)組(AA組),予雙下肢皮下注射創(chuàng)傷弧菌(濃度、劑量同上),從注射創(chuàng)傷弧菌后6h起,予腹腔注射(ip)頭孢哌酮鈉(180mg/kg)和乳酸左氧氟沙星(18mg/kg),每日2次,分別在注射創(chuàng)傷弧菌后9h、12h、16h、36t1、2周時(shí)活殺,各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物數(shù)均為10只.無(wú)菌取部分肝組織于液

3、氮中保存待用. 2.觀察VV組和AA組大鼠在染菌及藥物干預(yù)后的體溫、呼吸、精神狀態(tài)等情況的改變,隨機(jī)取VV組6h時(shí)間點(diǎn)和AA組2周時(shí)間點(diǎn)大鼠各1只,無(wú)菌取血后予常規(guī)血培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌. 3.采用Trizol試劑提取各組大鼠肝組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.然后以cDNA為模板,以大鼠CD14、TNF-α、IL-10引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果用凝

4、膠成像系統(tǒng)成像,Quanity One分析軟件進(jìn)行分析,以(目的基因/β-actin)為該基因表達(dá)的相對(duì)值. 4.提取各組肝組織細(xì)胞核蛋白,用Bradford法測(cè)定核蛋白濃度,采用生物素標(biāo)記的NF-kB標(biāo)記探針,使用凝膠電泳遷移分析法(EMSA)測(cè)定各組肝組織NF-kB的活性. 5.計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析等處理.P<0.05為差異有顯著性意義. 結(jié)果：1.

5、VV組染菌4h,大鼠出現(xiàn)呼吸急促、皮溫升高、下肢腫脹,且癥狀進(jìn)行性加重,染菌12h后大鼠出現(xiàn)紫紺、間斷抽搐等;AA組在藥物干預(yù)后上述癥狀逐漸減輕至消失,未見(jiàn)抽搐,大鼠均存活,取VV組6h時(shí)間點(diǎn)大鼠血培養(yǎng)可見(jiàn)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng),AA組2周時(shí)間點(diǎn)大鼠血培養(yǎng)未見(jiàn)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng). 2.正常大鼠肝組織CDl4mRNA表達(dá)量極低,VV組染菌2h、6h、9h、12h、16h的CD14mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.05),以染菌2h、6h為最高.A

6、A組染菌后9h肝組織CD14mRNA表達(dá)量仍明顯高于NC組(P<0.05),后逐漸降低,AA組染菌12h、16h、36h、2周的CDl4mRNA表達(dá)量與NC組相比均無(wú)明顯差異(P>0.05).與相同時(shí)間點(diǎn)的VV組相比,染菌9h、12h、16h時(shí)的AA組CD14mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05). 3.正常大鼠肝組織NF-kB活性較低,VV組染菌2h的肝組織NF-kB活性即達(dá)到高峰,較NC組明顯增高(P<0.05),后肝組織

7、NF-kB活性逐漸減少,但VV組染菌6h、9h、12h、16h肝組織NF-k B活性仍明顯高于NC組(P<0.05).AA組染菌后9h、12h肝組織NF-kB活性仍顯著高于NC組(P<0.05).后逐漸減低,AA組染菌16h、36h、2周的肝組織NF-kB活性與NC組相比,無(wú)明顯差異(P>0.05).與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的VV組相比,從組染菌9h、12h、16h的肝組織NF-kB活性明顯降低(P<0.05). 4.正常大鼠肝組織TNF-

8、α mRNA表達(dá)量較低,VV組染菌后2h、6h、9h、12h、16h的大鼠肝組織TNF-α mRNA表達(dá)量均明顯高于NC組(P<0.05);VV組染菌后9h、12h、16h的大鼠肝組織IL-10表達(dá)量亦明顯高于NC組(P<0.05);AA組染菌后9h、12h肝組織TNF-α mRNA 表達(dá)量仍明顯高于NC組(P<0.05),后逐漸低至正常,染菌16h、36h、2周的TNF-α mRNA表達(dá)量較NC組相比無(wú)明顯差異(p>0.05);AA組

9、染菌后9h、12h、16h的IL-10 mRNA表達(dá)量明顯高于NC組(P<0.05),后逐漸降低,染菌36h、2周的IL-10 mRNA表達(dá)量較NC組相比無(wú)明顯差異(P>0.05).與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的VV組相比,AA組染菌16h肝組織TNF-α mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05). 結(jié)論： 1.創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織CD14 mRNA表達(dá)量在膿毒癥早期即達(dá)高峰,膿毒癥過(guò)程中表現(xiàn)為持續(xù)增高,創(chuàng)傷弧

10、菌膿毒癥早期肝組織NF-кB活性即達(dá)高峰,創(chuàng)傷弧菌膿毒癥早期肝組織TNF-αmRNA明顯升高,膿毒癥中后期肝組織IL-10 mRNA才逐漸增多. 2.及早使用頭孢哌酮鈉和乳酸左氧氟沙星可明顯減低創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織CD14mRNA表達(dá)水平、肝組織NF-кB活性、以及肝組織TNF-α mRNA和IL-10mRNA表達(dá)水平.頭孢哌酮鈉聯(lián)用乳酸左氧氟沙星可顯著減少創(chuàng)傷弧菌膿毒癥時(shí)內(nèi)毒素受體的表達(dá),抑制NF-кB活性,有利于機(jī)體致炎