HBV相關性肝細胞癌外周血單個核細胞差異蛋白質組分析.pdf

1、目的：利用蛋白質組學方法建立分辨率高和重復性好的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相關性肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)、HBV相關性肝硬化(liver cirrhosis，LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及健康對照外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的雙向凝膠電泳(two-dim

2、ensional gel electrophoresis，2-DE)圖譜，識別鑒定其差異表達的蛋白質。為了驗證比較蛋白質組學研究結果，對部分差異表達的蛋白質進行免疫印跡(Western blot)驗證分析，并采用免疫組織化學技術檢測部分差異表達的蛋白質在肝組織中的表達狀況。尋找HBV相關性HCC早期診斷、癌變機制、治療及預后監(jiān)測的外周血特異性分子標志物。 方法： (1)采用密度梯度離心法分離HBV相關性HCC、LC、CH

3、B及健康對照靜脈血PBMC，用改良細胞裂解液裂解PBMC，抽取其總蛋白并利用蛋白質組學專用2-DE蛋白檢測試劑盒測定總蛋白含量。 (2)利用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離HBV相關性HCC(n=18)、LC(n=13)、CHB(n=12)及健康對照(n=10)PBMC的總蛋白質，先將固相化pH3-10NL梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條進行第一向固相pH梯度等電聚焦(isoelectric fo

4、cusing，IEF)，取出IPG干膠條經平衡30min后進行第二向垂直十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，然后對2-DE凝膠進行藍銀染色并用LabScan掃描凝膠成像，接著采用PDQuest圖像分析軟件對2-DE凝膠圖譜依次進行蛋白質斑點檢測、背景消減、標準化、匹配、建立平均凝膠(matchset gel

5、)、比較差異等分析并識別差異表達的蛋白質。選取部分差異表達的蛋白質應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測得到相應的肽質指紋圖譜，最后搜索數(shù)據庫鑒定差異蛋白質點。 (3)對部分差異蛋白質點采用Western blot進行驗證分析。 (4)利用

6、免疫組織化學技術對HBV相關性HCC、LC、CHB病人肝組織及對照肝組織分析部分差異蛋白質點在肝組織中的表達水平。 結果： (1)檢測PBMC總蛋白的標準曲線回歸方程為Y=0.0032X+0.37，R<'2>=0.998。 (2)得到了分辨率較高、重復性較好的HBV相關性HCC、LC、CHB及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。HBV相關性HCC、LC、CHB及健康對照PBMC凝膠的平均蛋白質點數(shù)分別為1189±4

7、5、1016±41、1096±42及1123±39；組內的平均匹配率分別為91.6％、90.2％、90.7％及92.8％；同一組內3塊膠在第一向IEF方向上位置的偏差較小，分別為1.21±0.14mm、1.06±0.12mm、1.09±0.15mm及0.99±0.12mm，在第二向SDS-PAGE方向上位置的偏差也較小，分別為2.22±0.26mm、2.15±0.2mm、1.93±0.20mm及1.98±0.24mm。 (3)H

8、BV相關性HCC對比LC、CHB及健康對照PBMC凝膠的差異蛋白點，表達增強的個數(shù)分別是72±7、63±6及65±5，表達量降低的個數(shù)分別是34±5、24±4及27±4；隨機選取至少在50％的凝膠中均有相同變化及表達量相差3倍以上的差異蛋白質點共28個，對其進行質譜分析，鑒定出19個蛋白質，在HBV相關性HCC病人PBMC中表達明顯增強的有熱休克蛋白質(heat shock protein，HSP)27、ras癌基因家族(RAB14)、

9、肌動蛋白、α<,1>-抗胰蛋白及RNA結合蛋白調節(jié)亞基等15個蛋白點；而PDX2、PDX6、HSPA8及錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)在HCC病人PBMC中低表達。這些差異蛋白質點主要為蛋白質合成與分解、分子伴侶、解毒和DAN修復相關蛋白質、三大代謝相關酶類、細胞結構相關蛋白質以及信號傳導相關蛋白質等六類。 (4)Western blot對差異表達蛋白質MnSOD及H

10、SP27半定量分析結果與比較蛋白質組學研究結果一致。HBV相關性HCC與LC、CHB、健康對照及胃癌病人比較，PBMC中HSP27表達明顯增高(P<0.01)，MnSOD表達量明顯降低(P<0.01)。 (5)免疫組織化學結果顯示，與對照肝組織相比，HSP27在HBV相關性HCC肝組織癌細胞中表達顯著增強(P<0.01)；LC(P=0.15)及CHB(P=0.69)肝組織中HSP27的表達均很低，與對照肝組織相比均無明顯差異。

11、 結論： (1)成功地建立用蛋白質組學技術分析PBMC的實驗方法。 (2)建立了分辨率高且重復性較好的HBV相關性：HCC、LC、CHB及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。 (3)鑒定出差異表達蛋白質19個，表達明顯增強有15個，明顯下降的有4個，其中某些可能成為HBV相關性：HCC早期診斷、癌變機制、治療及預后監(jiān)測的外周血特異性分子標志物。 (4)HSP27在HBV相關性HCC、LC、CHB及健康