半夏變異類(lèi)型的HPLC及ISSR指紋圖譜分析.pdf

1、本文對(duì)半夏生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥理活性及毒性的研究進(jìn)展作一綜述，為后續(xù)研究提供參考；對(duì)不同變異類(lèi)型半夏的鳥(niǎo)苷含量、HPLC指紋圖譜、ISSR指紋圖譜進(jìn)行研究，為進(jìn)一步選育優(yōu)良種質(zhì)、引種及規(guī)范化種植提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要得到以下結(jié)果： 1．鳥(niǎo)苷含量的測(cè)定 采用反相高效液相色譜法，以甲醇—水—醋酸(5：95：0.01)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫為25℃，流速1.0ml/min，對(duì)半夏不同栽培類(lèi)型中鳥(niǎo)苷的含量進(jìn)行測(cè)定，含量

2、在0.0114～0.155％之間，其中單葉半夏中鳥(niǎo)苷含量最高，為0.155％，其次是雙珠芽半夏，為0.150％。該方法可用于半夏藥材中鳥(niǎo)苷的含量測(cè)定。 2．HPLC指紋圖譜的研究 建立了半夏不同栽培類(lèi)型高效液相色譜指紋圖譜的研究方法。確定了指紋圖潛的測(cè)定條件，色譜柱：cosmosilODS(4.6mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相：A色譜甲醇，B純水；線性梯度洗脫：0.01-5 min100％B，5-15 min100

3、％-97％B，15-25 min97％-95％B；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：54 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。通過(guò)分析指紋圖潛，確定了11個(gè)峰為半夏藥材指紋圖譜的共有峰，構(gòu)成該藥材特有的色譜指紋圖譜特征，以4號(hào)峰為參照物，對(duì)其他色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，作為技術(shù)參數(shù)評(píng)價(jià)指紋圖譜。通過(guò)對(duì)指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，可以將不同變異類(lèi)型半夏進(jìn)行判別分類(lèi)。HPLC指紋圖譜可以用于較全面地考察半夏藥材的質(zhì)

4、量。 3．ISSR指紋圖譜的研究 (1)半夏ISSR反應(yīng)體系的建立 采用改良CTAB法提取半夏基因組DNA，經(jīng)A260和A280比值的測(cè)定，以及電泳檢測(cè)和PCR擴(kuò)增，表明改良CTAB法所提取的DNA在純度、完整性都較好。建市了半夏最佳ISSR反應(yīng)體系：25μL反應(yīng)體系中含2.5μL10×buffer、2.0 mmol/L，MgCl2、0.4mmol/L dNTPs、25ng模板DNA、0.5U Taq DNA聚合

5、酶。最佳反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50s，41℃-51.2℃(退火溫度隨引物不同而定)50s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)39次，72℃最后延伸5min，4℃保存。 (2)半夏種質(zhì)資源遺傳多樣性分析 從50條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性好的5條引物。共擴(kuò)增出41個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8條，DNA片段大小分布在0.2-3.0kb之間。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性也存在較大的差異，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶