大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞及其保護(hù)移植胰島功能的研究.pdf

1、目的：(1)觀察高血糖狀態(tài)下大鼠骨髓中是否存在胰島樣細(xì)胞。 (2)建立體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的方法，確定其生物學(xué)特性。 (3)體外誘導(dǎo)BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞，評(píng)估其生物學(xué)功能。 (4)探討B(tài)M-MSCs在糖尿病大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的潛能。 (5)觀察BM-MSCs對(duì)移植胰島功能的保護(hù)作用。 方法：(1)分別采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)或高糖誘導(dǎo)S

2、prague-Dawley(SD)大鼠糖尿病動(dòng)物模型和一過(guò)性高血糖狀態(tài)，同齡正常SD大鼠作對(duì)照。經(jīng)密度梯度離心法分離、貼壁法培養(yǎng)原代骨髓細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關(guān)激素的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)胰島相關(guān)激素、β細(xì)胞標(biāo)志(GLUT-2、GK、GLP-1R)和轉(zhuǎn)錄因子(PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2)基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰島相關(guān)激素的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以及胰島素與CD4

3、5/CD90共表達(dá)率，ELISA檢測(cè)葡萄糖刺激的胰島素分泌量(GSIS)。 (2)采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞倍增時(shí)間，纖維母細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)(CFU-F)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。采用免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD45/CD90、CD45/CD29表達(dá)及陽(yáng)性率。并分別子成骨和成脂誘導(dǎo)分化，VonKossa染色觀

4、察成骨細(xì)胞鈣鹽沉積，油紅O染色顯示脂肪細(xì)胞脂滴形成。 (3)采用葡萄糖、尼克酰胺和exendin-4體外誘導(dǎo)BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞。倒置顯微鏡和電鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，雙硫腙染色鑒定胰島樣細(xì)胞團(tuán)，RT-PCR法檢測(cè)胰島發(fā)育及其功能相關(guān)基因的表達(dá)，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關(guān)激素的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰島素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度，ELISA檢測(cè)GSIS。胰島樣細(xì)胞門靜脈移植治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠

5、，觀察血糖變化。 (4)予BrdU標(biāo)記分離培養(yǎng)的SD大鼠BM-MSCs，通過(guò)門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，監(jiān)測(cè)血糖變化，并通過(guò)免疫組織化學(xué)法觀察BrdU和胰島素雙陽(yáng)性細(xì)胞的分布。 (5)分離培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs和胰島，予體外混合培養(yǎng)，檢測(cè)胰島的存活率和GSIS，評(píng)估其功能。然后予BM-MSCs聯(lián)合胰島門靜脈移植治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，觀察血糖的變化。 結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的正常大

6、鼠骨髓細(xì)胞可以貼壁生長(zhǎng)，單個(gè)散在或形成數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆，呈圓形、多角形、長(zhǎng)梭形等多種形態(tài)，未檢測(cè)到胰島相關(guān)激素的基因和蛋白表達(dá)。而一過(guò)性高血糖組和糖尿病組骨髓細(xì)胞可形成細(xì)胞團(tuán)簇，表達(dá)胰島素、C肽、胰高血糖素(Gcg)、生長(zhǎng)抑素(SS)和胰淀粉樣多肽(IAPP)蛋白，并檢測(cè)到相應(yīng)激素和GLUT-2、GK、GLP-1R及PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2基因的表達(dá)。一過(guò)性高血糖恢復(fù)組以上基因表達(dá)消失。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯

7、示，糖尿病組骨髓胰島素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(6.9±2.9)﹪，C肽陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(6.6±1.3)﹪，Gcg陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(8.2±0.4)﹪，SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(2.3±1.1)﹪，IAPP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(2.3±0.7)﹪。其中，胰島素與CD90的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5.9﹪,胰島素與CD45的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為1.9﹪。糖尿病組骨髓細(xì)胞未檢出葡萄糖刺激的胰島素分泌。(2)BM-MSCs呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增時(shí)間約為59～67小時(shí)，細(xì)胞

8、周期G0-G1期占(76.8±4.8)﹪，增殖指數(shù)為(23.2±4.8)﹪，CFU-F檢測(cè)的集落形成能力為(140±24.2)/104細(xì)胞。BM-MSCs細(xì)胞表面CD90和CD29的陽(yáng)性率分別為(96.3±1.7)﹪和(93.9±0.8)﹪，而CD45陽(yáng)性率僅為(0.3±0.4)﹪。成骨和成脂誘導(dǎo)可以使BM-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。 (3)BM-MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞形成團(tuán)簇狀分布，少數(shù)聚集成

9、團(tuán)，直徑80～200μm，半懸浮于培養(yǎng)瓶中，雙硫腙染色陽(yáng)性。電鏡顯示此類細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多分泌顆粒。誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)胰島素、Gcg、SS、IAPP、GLUT-2、GK、GLP-1R、PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、Nkx2.2基因和胰島素、C肽、Gcg、SS、IAPP蛋白。尼克酰胺和exendin-4誘導(dǎo)組胰島素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約為20﹪，胰島素平均熒光強(qiáng)度增加約2.5倍，可以分泌少量胰島素，葡萄糖刺激的胰島素產(chǎn)量增加約1.5倍

10、，門靜脈移植治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，術(shù)后6天血糖逐步下降，12～16天血糖降至15mmol/L以下，但20天后血糖逐步上升，治療作用消失。 (4)BrdU標(biāo)記的BM-MSCs的陽(yáng)性率約為5～10﹪，予門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，2周血糖無(wú)明顯變化。胰腺局部注射組2周后胰腺內(nèi)可見(jiàn)散在浸潤(rùn)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，少數(shù)呈BrdU和胰島素雙陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)。門靜脈注射組2周后肝臟、胸腺、脾臟和胰腺內(nèi)均可見(jiàn)局部浸潤(rùn)的B

11、rdU陽(yáng)性細(xì)胞，但僅在胰島內(nèi)可見(jiàn)少數(shù)BrdU和胰島素雙陽(yáng)性細(xì)胞。 (5)大鼠BM-MSCs和新鮮分離的胰島混合培養(yǎng)后，BM-MSCs呈貼壁生長(zhǎng)，胰島半懸浮于BM-MSCs細(xì)胞層上。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胰島的存活率逐步下降?；旌吓囵B(yǎng)組第1、3、6、12天胰島的存活率明顯大于胰島單獨(dú)培養(yǎng)組(P＜0.01)。GSIS檢測(cè)結(jié)果顯示，第1天和第3天高糖可以明顯刺激胰島分泌胰島素(P＜0.01)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胰島對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性明

12、顯減弱，刺激指數(shù)從3.0～3.3降至1.7～1.8。第六天，體外培養(yǎng)的胰島喪失了對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性?；旌吓囵B(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組胰島無(wú)顯著差異。胰島移植組術(shù)后8天內(nèi)血糖可控制在15mmol/L以下，但隨后血糖逐步升高。BM-MSCs聯(lián)合胰島移植組術(shù)后血糖低于15mmol/L的時(shí)間可延長(zhǎng)到12天，但隨后血糖亦逐步上升，治療作用消失，而B(niǎo)M-MSCs移植組血糖無(wú)明顯降低。 結(jié)論：(1)長(zhǎng)期和一過(guò)性高血糖狀態(tài)均可以誘導(dǎo)大鼠骨髓出現(xiàn)胰島樣細(xì)胞，

13、可能是骨髓中的成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)。 (2)體外培養(yǎng)可以獲得大量生物學(xué)特性均一的大鼠BM-MSCs，并具有成體干細(xì)胞的分化能力。 (3)大鼠BM-MSCs在體外可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞。尼克酰胺和exendin-4可以有效促進(jìn)BM-MSCs分化為功能性胰島素分泌細(xì)胞。 (4)BM-MSCs在糖尿病大鼠胰腺內(nèi)可以轉(zhuǎn)分化為胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，但尚不能降低糖尿病大鼠血糖水平。 (5)體外培養(yǎng)條件下，BM-MSCs