松江鱸(Trachidermus fasciatus)肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和Hepcidin基因的克隆、表達和功能分析.pdf

1、松江鱸(Trachidernus fasciatus)是一種降海洄游性魚類，被列為國家Ⅱ級保護動物。為恢復其自然種群，人工養(yǎng)殖目前已成為必然趨勢，但養(yǎng)殖過程中日益頻發(fā)的病害問題成為松江鱸養(yǎng)殖所面臨的一大難題。為了尋求預防松江鱸疾病的有效手段，本實驗室致力于松江鱸免疫相關基因的研究。
　　肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)是磷酸原激酶家族中的一員，主要功能是催化肌酸與ATP之間高能磷酸鍵的可逆性轉移，為肌肉收縮和其他生

2、命活動提供能量來源。有研究發(fā)現，文昌魚CK具有抗菌活性，在文昌魚固有免疫中發(fā)揮一定的作用。Hepcidin是一類由肝臟分泌的肽類激素，是抗菌肽家族中的一員，在抗菌方面發(fā)揮著重要的作用，同時Hepcidin也是鐵離子代謝的主要調節(jié)者。為了深入了解這兩個基因，本實驗對松江鱸CK和Hepcidin基因的部分免疫學功能進行了研究。實驗通過RACE技術克隆獲得了兩種基因的cDNA全長，并分別命名為TfM-CK和Tf-Hepcidin;利用熒光實時

3、定量PCR技術分析其在mRNA水平上的組織分布，以及病原體刺激后的免疫相關組織的表達模式變化;同時構建真核、原核表達載體，獲得重組蛋白，并對其活性和功能進行體外和體內的檢測。
　　1.經體內、體外實驗證明肌酸激酶（CK)可能作為免疫因子參與松江鱸的固有免疫
　　TfM-CK的cDNA序列全長為1474 bp，開放閱讀框(ORF)為1146 bp，編碼381個氨基酸，SMART結構域預測表明，TfM-CK包含兩個結構域，一個是

4、N端的ATP-gua_PtransN結構域，一個是C端ATP-guaPtrans結構域。系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，所有的魚類M-CK聚為一大支，其他脊椎動物的M-CK聚為一大支，TfM-CK與鲇形目的無備平鲇（Sebastes inermis）的M-CK關系最近。qRT-PCR結果顯示，TfM-CK廣泛表達于松江鱸各個組織，但存在一定的組織差異性，其中在肌肉中表達量最高，血液次之。經鰻弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后，松江鱸

5、的皮膚、頭腎、肌肉和脾臟中的TfM-CK均上調表達。TfM-CK可以和肽聚糖(Peptidoglycans，PGN)、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和脂磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)三種糖結合、凝集多種細菌、一定程度上抑制巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的生長，且在鯉魚（Cyprinus carpio）致死實驗中鯉魚

6、的死亡率降低了65％。
　　2.實驗證明Hepcidin作為一種抗菌肽既可以作為效應子又可以作為模式識別受體發(fā)揮作用
　　Tf-Hepcidin的cDNA序列全長為988 bp，開放閱讀框(ORF)為273 bp，編碼90個氨基酸。信號肽預測表明從1-24位氨基酸為信號肽，25-64位氨基酸為前肽，65-90位氨基酸為最終的成熟肽，且成熟肽蛋白中有8個保守的半胱氨酸殘基。系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明所有的魚類Tf-Hepcidin聚為

7、一大支，其他脊椎動物的Tf-Hepcidin聚為一大支，Tf-Hepcidin與鱸形目的舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)的Hepcidin關系最近。qRT-PCR結果顯示，Tf-Hepcidin廣泛表達于松江鱸各組織中，在肝臟中的表達量最高，而在其他組織中表達量都較低。LPS和重金屬刺激后松江鱸的肝臟、皮膚、鰓、脾臟、血和腦組織中的Tf-Hepcidin表達量均上調。管碟法抑菌實驗表明，Tf-Hepcidin可以抑制大