ERK1-2參與外源性bFGF對(duì)放射性腦損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射性腦損傷(radiation injuries，brain；RIB)在臨床上常見(jiàn)于原發(fā)或繼發(fā)的頭頸部腫瘤放射治療后，也可由工業(yè)生產(chǎn)中放射事故性損傷引發(fā)。當(dāng)RIB一旦形成并產(chǎn)生臨床癥狀時(shí)在病程中往往已進(jìn)入不可逆階段，不僅嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，也給患者的家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前臨床對(duì)RIB治療以脫水劑、激素及對(duì)癥支持治療為主，無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)其病情變化，所以尋找有效的治療方法十分必要。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bas

2、ic fibroblast growth factor，bFGF)可抑制輻射誘導(dǎo)的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)凋亡，并對(duì)RIB有一定的治療作用，然而其具體作用機(jī)制尚不明確。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)的

3、一種，處于多條信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且是bFGF與其受體結(jié)合后所激活通路的中心環(huán)節(jié)，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控有望為RIB治療提供新的思路。本課題擬從離體NSC到活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)ERK1/2在bFGF對(duì)輻射誘導(dǎo)的NSC凋亡的調(diào)控作用及在體RIB的保護(hù)作用進(jìn)行觀察，以期進(jìn)一步明確bFGF治療RIB的可能機(jī)制，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為三部分： 1、ERK1/2參與bFGF抑制輻射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的作用研究；

4、 2、直線加速器全腦分割照射建立放射性腦損傷模型； 3、ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與外源性bFGF對(duì)放射性腦損傷的保護(hù)作用。 研究目的： 觀察外源性bFGF對(duì)放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的影響，探討ERK1/2在bFGF對(duì)放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的抑制效應(yīng)中的作用。 研究?jī)?nèi)容： 采用nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定C17.2NSCs。MTT法檢測(cè)外源性bFGF對(duì)C17.2 NSCs

5、細(xì)胞活性的影響，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)放射后早期凋亡，尋找出有效bFGF濃度后，進(jìn)一步加入MEK通路的特異性阻斷劑U0126，Western blot法檢測(cè)FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2在C17.2 NSCs的表達(dá)。 結(jié)果： 1.NSCs培養(yǎng)鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示95％NSCs呈Nestin陽(yáng)性染色； 2.外源性bFGF抑制放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示隨著bFGF濃度增加細(xì)

6、胞凋亡率明顯降低，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。bFGF濃度為50ng/ml時(shí)已可逆轉(zhuǎn)大部分8Gy射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，100ng/ml時(shí)對(duì)C17.2NSCs凋亡的抑制作用最明顯，以100ng/ml作為有效濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 3.ERK1/2在外源性bFGF抑制放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡中的作用研究：加入bFGF培養(yǎng)后，可誘導(dǎo)C17.2NSCs表達(dá)FGFR1，且ERK1/2、p-ERK1/2蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)；加入MEK1/2特異性抑

7、制劑U0126后，bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)的FGFR1和ERK1/2蛋白表達(dá)水平未受明顯影響，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯減少。 結(jié)論： 建模后采用尾靜脈直接注射給藥法對(duì)模型鼠給予外源性bFGF、U0126、DMSO，進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)，免疫組織化學(xué)染色和Western Blot免疫蛋白印跡方法檢測(cè)大鼠海馬FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，HE染色和GFAP、CNPase免疫組織化學(xué)染色觀察組織病理

8、學(xué)改變。 結(jié)果： 1.學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)：各處理組與模型組相比，學(xué)習(xí)記憶能力有顯著改善(P<0.01)；U0126組學(xué)習(xí)記憶能力明顯較bFGF治療組及DMSO組差(P<0.01)，但DMSO組與bFGF治療組比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2.FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2檢測(cè)結(jié)果：免疫組化及Western blot檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬有微弱FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋

9、白表達(dá)；bFGF治療組、U0126組及DMSO組大鼠海馬內(nèi)FGFR1、ERK1/2蛋白表達(dá)水平相近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但均較模型組明顯增多(P<0.01)；bFGF治療組及DMSO組大鼠海馬內(nèi)p-ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別(P>0.05)，但較模型組和U0126組明顯增大(P<0.01)，U0126組亦顯著大于模型組(P<0.01)。 3.組織病理學(xué)檢測(cè)：HE染色顯示，組織損傷以模型組最為嚴(yán)重，其次為U0126組

10、，bFGF治療組與DMSO組相比差異不明顯；bFGF治療組GFAP平均陽(yáng)性灰度值明顯大于模型組(P<0.05)及U0126組(P<0.01)，與DMSO組相比則無(wú)明顯差異(P>0.05)，且與模型組相比，其它三組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞著色深且均勻，突起多、長(zhǎng)；bFGF治療組CNPase平均陽(yáng)性灰度值明顯大于模型組及U0126組(P<0.05)，與DMSO組相比則無(wú)明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 外源性bFGF經(jīng)尾靜脈注入R