白藜三醇結(jié)合蛋白與血管平滑肌細胞增殖關(guān)系的研究.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是當今威脅人類健康的重要疾病之一。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是目前治療冠心病的重要手段，但是較高的術(shù)后再狹窄的發(fā)生率(15～20％)，成為急需解決的臨床問題。大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞(VSMC)的遷移、增殖和細胞外基質(zhì)的分泌是動脈粥樣硬化斑塊形成和再狹窄發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。因此，要預(yù)防冠心病的發(fā)生、減少介入治療術(shù)后再狹窄的發(fā)生率，發(fā)掘能抑制靶部位平滑肌細胞增生的新藥物并闡明其作用機制非常重要。 迄今

2、為止，諸多研究均提示白藜三醇是一種具有心血管保護作用的多酚類化合物。其中一個重要的機制是白藜三醇可通過抑制血管平滑肌細胞的增殖來減少血管再狹窄的形成。根據(jù)白藜三醇的化學結(jié)構(gòu)特點，有學者設(shè)計了白藜三醇親和層析柱，并應(yīng)用該裝置分離、純化了白藜三醇結(jié)合蛋白(RTP)。該蛋白經(jīng)放射配基自顯影法證實可與白藜三醇特異性結(jié)合，而用質(zhì)譜分析該蛋白的氨基酸序列則證實其與醌氧化還原酶2(NQO2)有80％的同源性。 白藜三醇是否直接作用于RTP而產(chǎn)

3、生抑制平滑肌細胞增殖和血管內(nèi)膜增生的保護作用?RTP又是如何調(diào)控血管平滑肌細胞增殖的?這些問題目前都還沒有答案，需要我們?nèi)ヌ剿餮芯俊?目的：本課題擬研究以下問題：(1)分離、純化血管平滑肌組織中的RTP，觀察RTP和NQO2的關(guān)系；(2)白藜三醇對實驗性動脈粥樣硬化再狹窄形成的影響及對血管壁RTP表達的調(diào)控；(3)白藜三醇對血管平滑肌細胞增殖的影響及對胞漿內(nèi)RTP表達的調(diào)控；(4)RTP高表達和低表達對血管平滑肌細胞增殖的調(diào)控。

4、通過上述研究，從在體、細胞和分子三個層面來探討白藜三醇對RTP表達的影響及RTP對血管平滑肌細胞增殖的調(diào)控機制，為今后白藜三醇作為冠心病血管再狹窄新的靶向治療提供理論和實驗依據(jù). 方法： 1.制備白藜三醇親和層析柱，并從兔主動脈平滑肌組織中分離、純化RTP，采用蛋白質(zhì)電泳及western blot進行鑒定； 2.雄性新西蘭大白兔48只，隨機分為3組，分別按以下條件喂養(yǎng)：(1)普通顆粒狀兔飼料，(2)高膽固醇飼料，

5、(3)高膽固醇飼料+白藜三醇。喂養(yǎng)12周后，部分實驗動物行右側(cè)髂動脈球囊損傷制備再狹窄模型。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后，處死所有實驗動物，進行以下檢查：(1)血管再狹窄檢查：雙側(cè)髂動脈對應(yīng)部位切片、H-E染色，用Leica Qwin顯微圖像分析軟件測量狹窄率和內(nèi)膜中膜面積比；(2)用Real-time PCR檢測雙側(cè)髂動脈壁RTPmRNA表達水平的改變；(3)用western blot檢測雙側(cè)髂動脈壁RTP蛋白表達水平的改變。 3.培養(yǎng)兔血

6、管平滑肌細胞并用不同濃度(1、10和50μmol/L)白藜三醇干預(yù)不同時間(24、48和72小時)，進行以下檢查：(1)用細胞計數(shù)方法觀察白藜三醇對平滑肌細胞增殖的影響；(2)用Reall-time PCR檢測白藜三醇對血管平滑肌細胞中RTP mRNA表達水平的影響；(3)用westem blot檢測白藜三醇對血管平滑肌細胞中RTP蛋白表達水平的影響。 4.構(gòu)建RTP的真核表達載體并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細胞，進行以下檢測：(1)用

7、半定量RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細胞中RTP的表達；(2)用BrdU細胞增殖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細胞增殖能力的改變。 5.構(gòu)建RTP的RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細胞，進行以下檢測：(1)用real-time PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細胞中RTP的表達；(2)用BrdU細胞增殖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細胞增殖能力的改變。 結(jié)果： 1.利用白藜

8、三醇親和層析柱可從兔血管平滑肌組織中分離、純化一個分子量約為26kD的蛋白質(zhì)，將其命名為RTP-26。該蛋白質(zhì)的分子量與文獻記載的NQO2分子量一致，并且在用RTP多克隆抗體，即NQO2抗體進行western blot時可以檢測到該蛋白。 2.在體實驗結(jié)果顯示白藜三醇能夠抑制動脈粥樣硬化再狹窄的形成。對照組、動脈粥樣硬化模型組和白藜三醇治療組的血管狹窄率分別為：63.04±3.33％.73.92士7.10％和28.10±5.83

9、％(三組間ANOVA檢驗，P<0.01)。 髂動脈壁RTP-26的mRNA和蛋白表達水平：白藜三醇明顯抑制了RTP-26的表達，mRNA表達較對照組降低了39％較模型組降低了44％(三組間ANOVA檢驗，P<0.01)；蛋白表達較對照組降低了35％較模型組降低了32％(三組間 ANOVA檢驗，P<0.01). 3.在細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)：(1)白藜三醇能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖，且具有濃度依賴和時間依賴的特點。(2)白藜

10、三醇抑制平滑肌細胞內(nèi)的RrP-26 mRNA表達。1、10和50μmol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細胞72小時，細胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達分別降低了56％、62％和95％，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。50μmol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細胞的時間達到48和72小時時，細胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達分別降低了53％和95％，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。(3)RTP-26蛋白的表達也明顯降低。10和50μm

11、ol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細胞72小時，細胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達降低15％和47％，與對照組相比也有統(tǒng)計學差異(P＜0.05和P<0.01)。50μmol/L兒白藜三醇干預(yù)平滑肌細胞48和72小時，細胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達降低36％和58％，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。所以，白藜三醇對血管平滑肌細胞中RTp-26 mRNA和蛋白的抑制作用也呈濃度依賴和時間依賴的特點. 4.RTP-26高表達載體pEGFP-

12、N1-NQO2成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細胞，48小時后細胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達升高1倍，且表達由綠色熒光蛋白和RTP-26組成的融合蛋白。但是，用BrdU細胞增殖檢測試劑盒測試，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-NQO2質(zhì)粒的平滑肌細胞與野生型細胞比較，增殖能力沒有明顯變化。 5.RTP-26 RNA干擾慢病毒載體Psc-NQO2構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞72小時，細胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達較野生型細胞減少74％.

13、延長轉(zhuǎn)染時間至14天，細胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達幾乎檢測不到。同時，用BrdU細胞增殖檢測試劑盒測試，轉(zhuǎn)染Psc-NQO2的平滑肌細胞與野生型細胞比較，增殖能力明顯降低(P<0.01)，且與25μmol/L白藜三醇干預(yù)72 結(jié)論： 1.用白藜三醇親合層析柱可以從血管平滑肌中分離、純化一個26kD的蛋白片斷，即白藜三醇結(jié)合蛋白26(RTP-26)，結(jié)合文獻和western blot結(jié)果，證實RTP-26即NQO2；

14、 2.高膽固醇飼料喂養(yǎng)新西蘭大白兔12周可產(chǎn)生動脈粥樣硬化損傷；球囊內(nèi)皮剝脫術(shù)可制備再狹窄動物模型。白藜三醇能夠抑制動脈粥樣硬化再狹窄的形成，這與其能夠抑制血管壁內(nèi)RTP-26 mRNA和蛋白的表達有關(guān)。 3.白藜三醇能夠抑制體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的增殖；白藜三醇也能夠抑制培養(yǎng)的平滑肌細胞胞漿內(nèi)RTP-26mRNA和蛋白的表達，且具有濃度依賴和時間依賴的特點； 4.RTP-26高表達對血管平滑肌細胞的增殖無影響；