小蒼蘭ISSR分子標記.pdf

1、小蒼蘭作為世界十大切花之一，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟效益。本文采用簡單重復(fù)序列間(ISSR，inter-simple sequence repeat)分子標記對現(xiàn)有的12份小蒼蘭種質(zhì)進行了研究，分析了其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為后續(xù)的小蒼蘭育種工作和品種保護提供理論依據(jù)。 首先，優(yōu)化了小蒼蘭的DNA提取方法。在改良CTAB法的基礎(chǔ)上，將研磨粉碎的樣品用dd-H2O水洗處理，同時在2XCTAB中加入0.0125mol/L的硼砂去除樣

2、品中的酚類物質(zhì)。在加入酚/氯仿/異戊醇之前，在提取液中加入0.35體積無水乙醇；同時在加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA之前，加入0.5體積5mol/L氯化鈉和后續(xù)PS Erasol處理去除多糖類物質(zhì)。DNA中混雜的RNA經(jīng)Rnase水解去除。利用優(yōu)化的DNA提取方法，對比了從小蒼蘭不同部位提取的DNA質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)幼嫩葉片為最佳的取材部位。利用優(yōu)化的提取方法，獲得了適合ISSR分子標記的高質(zhì)量小蒼蘭DNA，為下一步試驗提供了材料。 其

3、次，優(yōu)化了小蒼蘭ISSR-PCR的反應(yīng)體系。通過對比研究不同反應(yīng)體積對PCR結(jié)果的影響，我們選擇了25μL的反應(yīng)體系。利用五因素四水平的正交試驗，研究了鎂離子濃度、dNTPs濃度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量和引物用量對ISSR－PCR的影響，建立了適合小蒼蘭的ISSR－PCR反應(yīng)體系。在25μL的反應(yīng)體系中含有1×Taq DNA酶配套緩沖液(10mmol/L Tris·HCl，pH值9.0，50mmol/L KCl，0.1

4、％ Triton X-100)，2.0mmol/L MgCl2，0.06U/μL Taq DNA聚合酶，4ng/μL模板DNA，0.4 μmol/L 引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6mmol/L。同時，通過溫度梯度PCR確定了各引物最適宜的退火溫度。該優(yōu)化體系的建立為下一步對小蒼蘭進行ISSR分子標記奠定了基礎(chǔ)。 最后，利用優(yōu)化的ISSR－PCR反應(yīng)體系，對12份小蒼蘭種質(zhì)進行了ISSR的分子標記研究。數(shù)據(jù)經(jīng)