TLR4促進腫瘤細胞免疫逃逸和凋亡抵抗的分子機制研究.pdf

1、臨床與流行病學調查研究發(fā)現慢性感染和炎癥紊亂與腫瘤發(fā)生有關，其中慢性炎癥促進腫瘤免疫逃逸，被認為是導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。近年來腫瘤細胞表面表達的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關系倍受關注。研究證明，在慢性感染或炎癥條件下，TLR4誘導腫瘤細胞生成大量的免疫抑制性因子抑制免疫細胞啟動免疫應答，同時局部感染細胞大量增殖并抵抗凋亡促進細胞存活。因此打破腫瘤免疫逃逸可能成為預防和治

2、療腫瘤的重要手段。雷帕霉素(Rapamycin)是一種廣泛用于治療自身免疫和移植排斥疾病的免疫抑制劑，最近幾年用于治療腫瘤、抑制血管形成并促進腫瘤細胞凋亡。因此，我們提出Rapamycin這種抗炎藥物是否能夠阻斷TLR4介導腫瘤免疫逃逸，從而起到抗腫瘤的效應。 研究結果發(fā)現，人HT29和鼠CT26結腸癌細胞組成性地表達較高水平的TLR4，提示TLR4信號可能促進結腸癌細胞免疫逃逸。首先我們用RT-PCR方法檢測TLR4信號對免疫

3、抑制因子表達譜的影響，結果顯示，LPS刺激后，LPS上調CT26細胞中IL-6和COX-2的表達，隨后證明LPS刺激能夠促進IL-6和PGE2的合成，這些因子不僅抑制免疫細胞功能而且能夠促進腫瘤轉移、浸潤和存活。由于IL-6和PGE2是非常重要的調節(jié)多種細胞增殖、凋亡、遷移和浸潤的分子，因此，我們進一步研究是否LPS能夠通過IL-6和PGE2自分泌促進細胞轉移和浸潤，以及是否Rapamycin抑制了LPS誘導IL-6和PGE2的產生，從

4、而降低CT26細胞的活力。在臨床治療時，Rapamycin可能通過抑制結腸癌細胞分泌IL-6和PGE2而發(fā)揮抑制結腸癌轉移的抗腫瘤效應。 Rapamycin抑制TLR4信號促進CT26結腸癌細胞IL-6、PGE2分泌并降低LPS誘導的凋亡抵抗。那么，其可能的分子信號機制如何呢?首先我們利用FACS對TLR4受體膜表面的表達進行分析，發(fā)現Rapamycin能夠抑制TLR4在細胞膜上的表達，但對TLR4的轉錄水平沒有影響，提示Rap

5、amycin可能通過轉錄后調節(jié)如抑制TLR4的糖基化或向胞膜的轉運過程而降低膜表面的表達，Rapamycin介導TLR4的下調可能削弱了LPS所誘導腫瘤的免疫逃逸。隨后我們對TLR4介導的MAPKs、Akt和NF-kB信號途徑進行了研究。結果發(fā)現，在CT26細胞中，Rapamycin對LPS誘導的MAPKs激酶p38、ERK1／2、JNK1／2的活化沒有影響，但顯著抑制了Akt磷酸化及NF-KB信號途徑。提示Rapamycin可能通過抑

6、制這兩條信號通路從而抑制IL-6和PGE2的合成及凋亡抵抗逆轉。為了證實這一點，Akt和NF-KB信號分子特異性的抑制劑LY209400及PDTC處理阻斷信號后，ELISA檢測免疫抑制性因子的生成，結果顯示與Rapamycin~H似，LY209400及PDTC均能有效抑制IL-6和PGE2的分泌；同樣地，LY209400及PDTC均能有效逆轉LPS對腫瘤藥物OXL和DXR的抵抗作用?？赏茢郣apamycin作用于Akt和NF-KB信號分

7、子抑制TLR4介導的CT26分泌IL-6和PGE2及OXL和DXR誘導的凋亡抵抗。 綜上所述，Rapamycin能夠降低結腸癌TLR4膜表面的表達和抑制Akt／IKKα／β/NF-KB級聯通路，從而抑制了TLR4介導的結腸癌細胞自分泌IL-6和PGE2及其所誘導的腫瘤遷移和浸潤，并逆轉了TLR4所介導結腸癌細胞凋亡抵抗。本實驗結果從新的角度解釋了Rapamycin通過抑制參與免疫逃逸的因子的形成及增強抗腫瘤藥物敏感性從而打破免疫

8、逃逸以發(fā)揮抗腫瘤效應，進一步提示了Rapamycin可用于結腸癌的治療。 高頻率重組蛋白-1(High-mobility group box-1，HMGB1)最初被鑒定為DNA體細胞轉錄調控協(xié)同因子。免疫刺激時，炎癥細胞和免疫細胞被活化導致HMGB1被包裝到溶酶體然后釋放到胞外環(huán)境；壞死或受損的體細胞以被動的方式釋放HMGB1。一旦釋放到胞外，HMGB1發(fā)揮致炎因子作用活化內皮細胞，促進血管形成，炎癥細胞和干細胞向血管外的遷移，

9、通過活化一系列關鍵信號途徑從而啟動炎癥反應，調節(jié)細胞的活化、生長及死亡。因此，HMGB1涉及到多種疾病，包括帕金森、膿血癥、缺血再灌注及自身免疫疾病。HMGB1到胞外環(huán)境且與腫瘤增殖和轉移有關。最近研究表明，HMGB1與腫瘤增殖和轉移有關，而且，HMGB1是TLR4的內源性配體，因此，我們研究了在放療和生物治療過程中由壞死細胞釋放的HMGB1是否能夠作為一個旁分泌因子促進肝癌的發(fā)展。我們研究發(fā)現，在放療和TRAIL治療過程中，源于死亡的

10、肝癌細胞株SMMC-7721上清能夠誘導SMMC-772l細胞表達免疫抑制性細胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1。為了確定是否死亡細胞釋放的HMGB1誘導了這種炎癥效應，我們干擾了SMMC-7221細胞HMGB1，結果發(fā)現，HMGB1干擾的壞死細胞的上清對MIP-3α的誘導能力顯著減弱，證實了死亡細胞釋放HMGB1并將信號傳遞于其周邊細胞。重組的HMGB1也能促進高水平MIP-3α的表達，進一步表明了上清中的H

11、MGB1促進了免疫抑制性細胞因子和趨化因子的表達。 由于HMGB1能夠介導神經節(jié)瘤的生長和擴散，所以我們研究了HMGB1和死亡細胞上清是否能夠促進肝癌細胞增殖。MTT檢測發(fā)現，HMGB1能夠促進SMMC-7721增殖，BrdU參入法檢測細胞增殖進一步證實死亡細胞上清和HMGB1能夠促進肝癌細胞生長。然后，我們研究了是否HMGB1通過加速細胞周期進程從而促進肝癌細胞增殖。細胞周期分析表明，重組HMGB1加速G1向S期的轉化，從而促

12、進肝癌細胞的生長。這些實驗結果提示，由于放療和化療誘導死亡細胞可能通過釋放高水平HMGB1加速細胞周期進程從而促進腫瘤的生長和惡化。 如前面所述，重組HMGB1和源于死亡細胞的上清能夠促進肝癌SMMC-7721細胞免疫抑制細胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α，IP-10 和IMCP-1的表達。另外，HMGB1是TLR4內源性配體，因而，為了進一步證實HMGB1是否通過TLR4／MyD88信號途徑而介導免疫逃逸的誘導，我們構建了

13、針對于SMMC-7721細胞TLR4和HMyD88的干擾載體。RT-PCR檢測表明，HMGB1或死亡細胞上清處理TLR4或MyD88缺陷的SMMC-7721細胞后，對MIP-3αmRNA誘導表達能力顯著降低，說明重組的HNGB1和死亡細胞的上清介導MIP-3α表達依賴于TLR4／MyD88信號途徑。 另外，與LPS刺激相似，HMGB1能夠活化SMMC-7721細胞p38MAPK、ERK1／2、JNK和NF-KB信號通路。因此，我

14、們研究了HMGB1是否通過MAPK或NF-K B參與細胞周期和凋亡抵抗的調節(jié)。Western blot檢測表明MEK1／2(PD98059)和ERK1／2(U0126)抑制劑能夠顯著抑制HMGB1誘導的SMMC-7721細胞p27磷酸化及其降解以及周期素D1的表達。而NF-KB抑制劑PDTC下調HMGB1所誘導的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達。因此，HMGB1／TLR4誘導的肝癌細胞周期轉化是由MEK1／2／ERK1／2信號通路介導，而N

15、F-KB是促進HMGB1誘導肝癌細胞凋亡抵抗的關鍵信號分子。因此，HMGB1／TLR4信號介導肝癌細胞凋亡抵抗和加速細胞周期轉化過程，從而促進肝癌免疫逃逸和進一步發(fā)展。 綜上所述，由30 Gy-co-ray放療或TRAIL處理所導致死亡的肝癌細胞的分泌上清能夠反饋性地誘導肝癌細胞表達免疫抑制細胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1，死亡的人肝細胞癌細胞釋放的HMGB1介導了此種效應。HMGB1通過增強cyc

16、linD表達及p27-T187磷酸化和降解而促進了肝癌細胞G1-S期的進程。另外，HMGB1可通過上調抗凋亡蛋白Bcl-xL而增強肝癌細胞對TRAIL誘導凋亡的抵抗，提示，放化療導致死亡的肝癌細胞釋放的HMGB1參與了腫瘤的逃避免疫和凋亡抵抗。干擾HMGB1或TLR4／MyD88之后，死亡的肝癌細胞以及重組HMGB1均不能有效誘導肝癌細胞表達MIP-3 α，進一步證實了HMGB1／TLR4／MyD88途徑依賴的放化療促進肝癌的免疫逃逸作