腎上腺髓質素在鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠腎臟表達的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者常見的微血管病變,它與糖尿病視網膜病、神經病變一起為糖尿病微血管病變最危險的并發(fā)癥,其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明。本研究用成年雄性Sprague-Dawle大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制成糖尿病模型。大鼠4周后處死,以免疫組織化學SABC法確定大鼠腎上腺髓質素(adrenomedu

2、llin,ADM)蛋白表達水平,用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE staining)染色光鏡觀察糖尿病腎臟組織的形態(tài)變化,同時制作大鼠腎臟的電鏡標本觀察其超微結構的改變,研究鏈脲佐菌素( streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病大鼠腎臟中ADM的表達情況,探討糖尿病腎病可能的發(fā)病機制,并為臨床治療糖尿病腎病提供理論依據和治療方法。 材料和方法: 1.實驗動物分組

3、 成年雄性Sprague-Dawle大鼠20只,體重150-180 g,年齡2個月左右,隨機分為正常對照組和糖尿病組,每組10只。 2.實驗模型建立 正常組大鼠禁食10h后,尾靜脈注射pH4.6,0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液,劑量為3 ml/kg,作為對照組;糖尿病組大鼠禁食10h后,用pH4.6,0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液溶解STZ,配成1%溶液,3 ml/kg尾靜脈注射,48 h后尾靜脈取血用血糖檢

4、測儀測定血糖,以及尿糖試紙測尿糖,將血糖≥16.7 mmol/L,尿糖(++)以上的大鼠定為糖尿病模型建立成功的標準;所有動物造模后均自由進食進水,以后每周測尿糖和血糖。 3.免疫組織化學染色 (1)取材 造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)4周;在4周后每組各取7只大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉;從左心室插管,用PBS(0.01 mol/L,pH7.4)溶液灌注100 ml;接著用4%多聚甲醛(0.01 mol/L,p

5、H7.4)溶液灌注300 ml后,取出腎臟在同種固定液中浸泡30 min,用PBS洗,以上操作均在4℃進行。 (2)切片制備 (3)免疫組化實驗及顯色 (4)貼片及封片 4.對照組用PBS代替一抗,其余步驟相同 5.HE染色 6.透射電鏡觀察腎臟組織超微結構 7.圖像分析與統計學處理 同一放大倍數(×400)、同一光強度下分析所有切片,每組大鼠各選10張相同部位DAB染色切

6、片,每張切片隨機測量5個視野,測量結果取平均值;采用UTHSCSA Image Tools3.0(美國德克薩斯大學醫(yī)學院開發(fā))圖象分析處理系統進行分析,統計切片單位面積內(mm2)陽性細胞的數量和光密度;數據采用SPSS10.0進行統計學處理,結果以x±s表示,采用t檢驗,p<0.05為顯著性差異。 結果: 1.體重、血糖與尿糖:糖尿病大鼠建模前,對照組體重164.2±6.3 g,血糖3,7±0.5 mmol/L,尿糖(

7、-);糖尿病組體重167.2±7.9 g,血糖3.6±0.4mmol/L,尿糖(-)。兩組間無顯著性差異(P>0.05)。成模后4周:對照組體重223.8±12.1g,血糖3.9±0.5 mmol/L,尿糖(-);糖尿病組體重159.1±18.1g,血糖30.4±2.8 mmol/L,尿糖(++)到(+++)。兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。 2.腎臟ADM的表達情況:淺棕黃色ADM免疫陽性顆粒在對照組與糖尿病組大鼠腎小管

8、上皮細胞的胞漿內均出現。但與對照組相比,糖尿病組ADM染色增強。具體而言,對照組大鼠腎臟單位面積ADM免疫陽性細胞數和光密度值分別為59.1±14.6/mm2和84.2±8.4,而糖尿病組腎臟單位面積ADM免疫陽性細胞數和光密度值分別為197.3±47.4/mm2和117.8±12.9(P<0.01)。 3.腎臟光鏡下HE染色的觀察:光鏡下腎小球的毛細血管球肥大,腎小囊腔呈裂隙狀,基底膜輕度增厚,系膜增生,腎小管上皮細胞顯示空泡

9、和顆粒變性。腎小管出現輕度擴張,腎小管之間間質增寬。 4.腎臟電鏡下超微結構的變化:電鏡下:腎小球毛細血管基底膜呈節(jié)段性增厚,上皮細胞部分足突融合、增寬,線粒體明顯腫脹,嵴突數目減少或斷裂,纖毛破壞,腎組織系膜細胞局部核內染色質趨邊濃縮、聚集。 討論: 1.糖尿病大鼠模型制作的研究 建立一種理想的糖尿病動物模型,對于深入研究糖尿病具有重要意義。一般常用四氧嘧啶或鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射一次成模,通常為

10、速發(fā)型大鼠糖尿病模型。其中,STZ的成模更為常用。STZ能直接破壞胰島B細胞,首先將其DNA堿基上的特殊位點烷基化,之后再進一步作用于ADP核糖體合成酶,從而使B細胞損傷。對于糖尿病大鼠血糖值的確立標準,通過國內外學者的深入研究,基本傾向于血糖值>16.65 mmol/L(300mg/dl)。本實驗選用SD大鼠空腹10小時,一次尾靜脈注射STZ3ml/kg,成模4周時血糖值達血糖≥16.7 mmol/L以上,并出現多飲、多尿、多食及體重

11、增加不明顯等癥狀,符合速發(fā)型糖尿病大鼠模型標準。 2.糖尿病腎病的病理結構變化 DN典型的病理結構變化為腎臟體積增大和腎小球肥大,并逐漸出現腎小球基底膜增厚以及進行性腎小球胞外基質(extracellular matrix,ECM)成份的聚集,最后腎小管間質細胞外基質(ECM)進行性積聚。而本研究觀察到光鏡下腎小球的毛細血管球肥大,腎小囊腔呈裂隙狀,基底膜輕度增厚,系膜增生,腎小管上皮細胞顯示空泡和顆粒變性。腎小管出現輕

12、度擴張,腎小管之間間質增寬,腎小球毛細血管基底膜呈節(jié)段性增厚,上皮細胞部分足突融合、增寬,與文獻報道一致。 3.腎上腺髓質素與糖尿病腎病的關系 ADM是在1993由Kitamura等首次從人嗜鉻細胞瘤中分離提純成功。近年來ADM在腎臟調節(jié)中的作用逐漸受到重視,高血糖可增加ADM的表達。這可能是因為高血糖激活了PKC的活性,使ADM表達增加,而在培養(yǎng)基中加入PKC的抑制劑,高血糖增加ADM表達的作用就被阻斷。DM的高血糖及

13、高FFA濃度可增加DAG的合成,進而激活PKC。而所以腎臟局部ADM表達的上升很可能是一種機體的代償機制,以對抗糖尿病高血糖條件下代謝紊亂造成的各種損傷信號,如Ang II系統活化、氧化應激增強、PKC過度激活等對腎臟的不良作用。而長期慢性高血糖情況下發(fā)生的失代償可能是DM大鼠血漿ADM水平先升高后降低的重要原因。另一項研究顯示,DM大鼠血漿ADM水平呈現先升高后降低的變化趨勢,而且ADM的血漿水平被認為可以反映DM病變的嚴重程度。而我

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