電離輻射后少突膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜改變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在大腦、頭頸部腫瘤和一些顱內(nèi)良性疾病的治療中，大腦和脊髓等重要的劑量限制性器官往往會(huì)臨近或位于射野范圍之內(nèi)，放射治療后除了部分病人死于腫瘤局部未控之外，約有50%的長(zhǎng)期生存患者會(huì)發(fā)生不同程度的放射性后遺癥，其中以放射性腦或脊髓損傷的病情較為嚴(yán)重，患者的生活質(zhì)量明顯降低?；谝陨显?，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的電離輻射效應(yīng)的研究已經(jīng)全面展開(kāi)。目前對(duì)于放射性腦損傷發(fā)病機(jī)理和早期診斷的研究還相對(duì)較少

2、，至今仍無(wú)有效的早期診斷和治療措施，所以這些研究工作對(duì)腫瘤放射治療學(xué)的發(fā)展有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 病理學(xué)改變的研究表明，早期腦損傷以血管系統(tǒng)變化為主，沒(méi)有特異性；晚期則出現(xiàn)較典型的脫髓鞘、膠質(zhì)細(xì)胞增生與退行性改變、毛細(xì)血管阻塞和白質(zhì)壞死等四大特征。由于血管損傷的廣泛性和少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocyte，OL）是CNS中唯一能合成髓鞘的細(xì)胞，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞和OL被確立為放射性腦損傷的輻射靶細(xì)胞，OL成為發(fā)病機(jī)

3、理研究的重點(diǎn)之一。隨著研究的深入，目前認(rèn)為主要有四種因素參與了放射性腦損傷的發(fā)生與發(fā)展，其分別是：血管損傷、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及成熟OL耗竭、神經(jīng)干細(xì)胞減少和細(xì)胞因子表達(dá)異常。 近幾年來(lái)，關(guān)于OL方面的研究大多集中于細(xì)胞和分子水平，主要內(nèi)容包括電離輻射后OL的凋亡及其發(fā)生機(jī)制、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和成熟OL的輻射反應(yīng)性以及輻射劑量與分割方式影響等方面。然而，對(duì)于OL的研究沒(méi)有與發(fā)生放射性脫髓鞘病變機(jī)制形成密切的相關(guān)性；早期和亞急性期細(xì)

4、胞、分子反應(yīng)的特性與晚期損傷病理學(xué)改變的關(guān)系仍不清楚。在神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究中，有許多關(guān)于“OL損傷”和“脫髓鞘病變”的文獻(xiàn)報(bào)道，脫髓鞘是普遍的或特征性的病變，OL也被證實(shí)是多種致病因素（外傷、缺血、缺氧和異常免疫反應(yīng)等）易受攻擊的靶細(xì)胞。目前的研究表明少突膠質(zhì)細(xì)胞系各階段的特異性標(biāo)志分子已基本明確，可以通過(guò)不同標(biāo)記物的組合來(lái)區(qū)分它們；少突膠質(zhì)—2型星形膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte—type2 astrocyt

5、e progenitor cells，O2A）離體培養(yǎng)的成功也為研究其增殖、遷徙、分化特性及與脫髓鞘病變的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型；在正常成年大腦與脊髓內(nèi)存在著約占膠質(zhì)細(xì)胞5～8%的具有分化潛能的前體細(xì)胞，一定程度的損傷性刺激后可以使它們發(fā)生增殖、遷徙、分化和再生，這為神經(jīng)損傷的治療提供了新的思路。 一、少突膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:獲得芯片檢測(cè)所需要的純化OL。 方法:采用改良的恒溫振蕩、差速貼壁法進(jìn)行O

6、2A的純化培養(yǎng)，并通過(guò)體外誘導(dǎo)分化使之為成熟的OL；應(yīng)用免疫熒光雙重標(biāo)記方法進(jìn)行OL的細(xì)胞鑒定。 結(jié)果: OL免疫熒光標(biāo)記為A285標(biāo)記陰性、MBP或GalC標(biāo)記陽(yáng)性；OL純度達(dá)98%，且細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×106個(gè)。 二、電離輻射后少突膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜變化的離體實(shí)驗(yàn) 目的:觀察電離輻射前后OL基因表達(dá)的早期變化規(guī)律。 方法:對(duì)純化的OL采用6MV—X線照射10Gy劑量，用表達(dá)譜芯片檢測(cè)比較對(duì)照組（1組）與

7、照射后1hr、4hr組（2、3組）各基因mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果:三組細(xì)胞雜交后的基因檢出率分別為42.81%、41.64%、45.31%；2比1上調(diào)基因數(shù)為27個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為164個(gè)，3比1上調(diào)基因數(shù)為295個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為302個(gè)，3比2上調(diào)基因數(shù)為510個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為320個(gè)；基因功能分類結(jié)果共有79大類1079個(gè)基因被列出，具體功能分類包括：細(xì)胞生理過(guò)程、腫瘤凋亡、新陳代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊、蛋白結(jié)合等。

8、 三、與早期放射性腦損傷相關(guān)的功能基因定量分析 目的:驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠性的同時(shí)進(jìn)一步探討候選基因在OL內(nèi)差異表達(dá)的意義。 方法:依據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果選出9個(gè)在早期放射性腦損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用的候選基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR的方法對(duì)其mRNA進(jìn)行定量分析。 結(jié)果;熒光定量RT—PCR基因定量與基因芯片分析結(jié)果比較，27個(gè)mRNA檢測(cè)結(jié)果中有22個(gè)結(jié)果一致，符合率為81.5%；三組樣本中各基因△Ct值分別為

9、：①膠質(zhì)原纖維酸性蛋白：1.3777、2.2266、5.3992；②髓鞘堿性蛋白：—3.4061、—2.6133、—2.0232；③載脂蛋白E：12.1203、14.7452、17.2264；④促甲狀腺激素釋放激素：5.8994、8.2740、2.4709；⑤甲狀腺激素受體α：6.3269、5.8081、6.4793；⑥轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2：4.6782、5.2108、5.1181；⑦早期生長(zhǎng)反應(yīng)2：10.0840、7.4766、8.575

10、4；⑧神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1：3.7024、3.9211、5.6716；⑨S100蛋白β多肽：2.5607、5.5696、4.2581。 結(jié)論： 1.通過(guò)改良的恒溫振蕩法和差速貼壁法進(jìn)行O2A的純化培養(yǎng)，并誘導(dǎo)分化為純化的OL，免疫熒光標(biāo)記為A285標(biāo)記陰性、MBP或GalC標(biāo)記陽(yáng)性；OL純度達(dá)98%，且細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×106個(gè)，符合基因芯片檢測(cè)要求。 2.照射后早期就發(fā)生了電離輻射導(dǎo)致的OL基因表達(dá)譜的改變；芯片檢

11、測(cè)結(jié)果提示發(fā)生變化的OL基因包括細(xì)胞損傷相關(guān)基因、細(xì)胞保護(hù)相關(guān)基因和損傷修復(fù)相關(guān)基因，這些基因之間的動(dòng)態(tài)平衡變化決定了輻射對(duì)OL的最終生物學(xué)效應(yīng)。 3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR的方法對(duì)候選基因mRNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果與芯片檢測(cè)基因mRNA的結(jié)果基本一致，兩者比較在檢測(cè)的特異性上更加近似，而檢測(cè)的敏感性上前者優(yōu)于后者；對(duì)侯選基因mRNA進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步了解了它們?cè)诜派湫阅X損傷早期的變化情況，GFAP、MBP、apoE、T