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文檔簡介
1、目的:
探討乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因對胃癌細胞生物學行為的影響;闡明HPSE基因在胃癌細胞信號轉導、生長發(fā)育、炎癥反應及腫瘤轉移等多項生物過程中的可能分子機制
方法
1、siRNA對胃癌細胞乙酰肝素酶基因表達及其生物學行為的影響
①應用RT-PCR技術篩選HPSE基因高表達的胃癌細胞株。②設計、合成反義寡脫氧核苷酸(AS-ODN)及對照寡脫氧核苷酸(NS-O
2、DN),轉染高表達HPSE基因的胃癌細胞株,利用Real-Time PCR技術確定沉默效果最佳的siRNA濃度,并運用Real-Time PCR和Western Blot技術分別在mRNA和蛋白水平驗證對HPSE基因表達的沉默效果。③應用透射電鏡觀察HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901形態(tài)學的影響;采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響。④應用Matri
3、gel侵襲實驗和細胞遷移實驗研究HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901侵襲力和遷移能力的影響。
2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對胃癌細胞基因表達譜的影響
應用Affymetrix Human U133 Plus2基因芯片技術,分別提取siRNA抑制HPSE基因表達前后胃癌細胞SGC-7901的總RNA,反轉錄成cDNA,進一步熒光標記后進行芯片雜交,雜交結果經掃描及軟件分析,最后Ratio值為Cy3/Cy
4、5(即實驗組/對照組)。差異基因篩選標準為正標Rmio(Cy3/Cy5)≥2,同時反標Ratio(Cy3/Cy5)≤0.5。分析siRNA抑制HPSE基因表達后,胃癌細胞中受HPSE調控的下游基因表達譜的變化,并且部分上調及下調基因的表達水平用Real-Time PCR進行了驗證。對于差異表達在2倍以上的基因,我們利用博奧公司的MAS3.0分析軟件進行了GO分析,并對差異表達在1.5倍以上的基因進行了Pathway分析。
5、結果
1、siRNA對胃癌細胞乙酰肝素酶基因表達及其生物學行為的影響
①RT-PCR技術檢測胃癌細胞株中HPSE基因表達情況,結果顯示SGC-7901細胞表達HPSE最高,故選用SGC-7901細胞為實驗細胞模型。②RT-PCR技術及Real-Time PCR實驗證實沉默效果最好的siRNA濃度為10 nM。⑦Real-Time PCR及Western Blot檢測:相對于陰性對照NC組(無義siRNA對照組
6、),siRNA沉默組的HPSE基因的mRNA水平和蛋白表達量顯著降低。④siRNA沉默HPSE基因后,透射電鏡結果顯示胃癌細胞SGC-7901形態(tài)學發(fā)生典型的凋亡現象;Annexin V-FITC/PI雙柒流式細胞術檢測發(fā)現凋亡細胞明顯增多,由正常細胞的1.58%升高為8.45%。⑤Transwell細胞侵襲實驗結果顯示,siRNA沉默HPSE基因后的胃癌細胞SGC-7901侵襲到Transwell膜后面的細胞數較陰性對照組顯著減少(P
7、<0.01),表明HPSE基因沉默明顯降低胃癌細胞的侵襲能力。利用細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力,結果顯示,HPSE基因沉默的胃癌細胞在劃痕后24h、36h的寬度明顯大于對照組(P<0.05),表明抑制HPSE基因可明顯降低胃癌細胞的遷移能力。
2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對胃癌細胞基因表達譜的影響
Affymetrix芯片結果表明,siRNA沉默HPSE基因后,胃癌細胞SGC7901中VEGF信號通路的中心介
8、導分子PRKCA和PRKCB的表達明顯下降;介導VEGFR-2通路的錨定蛋白SHB、VEGFR-2的相互作用蛋白VE-cadherin、炎癥因子IL-1a/IL-1b表達下降,介導天然免疫的分子DEFB1、黏附分子CD44表達升高。
結論
1、siRNA沉默HPSE基因后,降低胃癌細胞SGC-7901的侵襲和遷移能力;
2、siRNA沉默HPSE基因表達后,胃癌細胞SGC-7901中VEGF信號
9、通路的中心介導分子PRKCA和PRKCB的及傳遞該通路信號的重要分子SHB和VE-cadherin表達均下降,但跨膜糖蛋白CD44表達升高,這些分子改變可能共同參與了HPSE干涉后的血管生成抑制過程。
3、siRNA沉默HPSE基因后,SHB、VE-cadherin表達下降,CD44表達升高,FAK通路受到抑制,這些因素可能共同作用導致胃癌細胞SGC-7901的凋亡增加。
4、siRNA沉默HPSE基因后,炎
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