p38MAPK、ERK信號通路和小鼠病毒性心肌炎的關(guān)系研究.pdf

1、目的：探討p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regtJlatedkinase,ERK)信號通路和小鼠病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)的關(guān)系及動態(tài)變化. 方法：實驗選用95只清潔級近交系4-6周齡雄性Balb/C小鼠,隨機將小鼠分為兩組,正常對照組(C組)3

2、0只,每只小鼠腹腔注射不含病毒的1640培養(yǎng)液0.1ml;心肌炎組(E組)65只,每只小鼠腹腔接種0.1m110<'-5><'53>TCID<,50>/ml的柯薩奇病毒B<,3>(COXSaCkie viruses B<,3>CVB<,3>)復(fù)制心肌炎模型.定病毒接種日為第0天,分別于接種后第1天、3天、5天、7天和14天E組隨機抽取8只、C組取6只,眼球采血后處死并留取心臟標本.免疫組化、蛋白免疫印跡(Western-Blot)法檢測

3、心肌組織中磷酸化p38MAPK、ERK蛋白的含量;光鏡觀察心肌組織病理學改變,采用Rezkalla法計算炎癥積分;電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變;化學發(fā)光免疫法檢測血清中心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTn-I)水平;ELISA法檢測血清中白介素-1β(Interleukin-1β)含量. 結(jié)果：1.p38MAPK Western-Blot結(jié)果:Western-Blot結(jié)果顯示,心肌炎組小鼠在病毒接種后第1、3

4、天磷酸化p38MAPK含量增加,和正常對照組比差異有統(tǒng)計學意義,此后p38MAFPK下降,心肌炎組第5、7、14天小鼠和正常對照組比差異無統(tǒng)計學意義. 2.p38MAPK免疫組化結(jié)果:心肌炎組小鼠在病毒接種后第1天即出現(xiàn)p38MAPK明顯的磷酸化伴核轉(zhuǎn)位,持續(xù)活化至病毒感染后3天,和正常對照組比差異有統(tǒng)計學意義;第5、7、14天己基本降至正常對照組水平. 3.ERK Western-Blot結(jié)果:和正常對照組比,心肌炎組

5、小鼠在病毒接種后第1天、3天及第5天磷酸化ERK含量升高,第7天含量下降至正常對照水平,第14天含量又復(fù)增加.心肌炎組第1、3、5、14天磷酸化ERK含量升高,和正常對照組比差異有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為雙向活化. 4.ERK免疫組化結(jié)果:心肌炎組小鼠在病毒接種后第1天ERK即為強陽性表達,持續(xù)至第5天,第7天表達減弱,第14天又復(fù)表達增加.除第7天外,心肌炎組其余時問點小鼠心肌中磷酸化ERK含量升高,和正常對照組比差異有統(tǒng)計學意義.

6、 5.心肌病理改變及炎癥積分:正常對照組小鼠心肌細胞正常,心肌炎組小鼠CVB;接種后第3天,心肌細胞問及心肌內(nèi)的小血管周圍有少量炎癥細胞浸潤,逐漸加重,于病毒接種后第7天達到高峰,可見肌原纖維大面積壞死、溶解伴有大量炎癥細胞浸潤,病毒接種后第14天,心肌炎癥浸潤好轉(zhuǎn).小鼠的炎癥積分高峰出現(xiàn)在病毒接種后第7天,和正常對照組及心肌炎組其他時問點小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01). 6.小鼠死亡數(shù)量的變化:心肌炎組小鼠在

7、病毒接種后第3天出現(xiàn)癥狀,第4天出現(xiàn)死亡,死亡高峰出現(xiàn)在病毒接種后第8天,總死亡率32﹪. 7.小鼠心肌組織電鏡觀察:心肌炎組小鼠在病毒接種后第1天心肌細胞基本正常.第3天出現(xiàn)肌纖維變窄,部分溶解,大部分線粒體濃聚,排列稍紊亂,肌漿網(wǎng)擴張,少量細胞核出現(xiàn)固縮,肌膜下輕度水腫.第5天肌纖維明顯收縮,肌纖維疏松,肌絲溶解,閏盤間隙擴大,大部分細胞核固縮,線粒體濃聚,部分線粒體中有電子致密物沉積.第7天中度水腫,肌絲排列紊亂,肌纖維疏

8、松,肌絲溶解斷裂.第14天整個肌纖維輕度收縮,心肌纖維波浪狀改變,肌原纖維之間間隙增大,滲出和炎癥浸潤不明顯,線粒體形態(tài)不規(guī)則,顏色變深,細胞核固縮,核周間隙擴大. 8.血清cTn-I變化:心肌炎組小鼠在病毒接種后第3天血清cTn-I開始升高,第5天達高峰,然后逐漸下降,14天仍稍高于正常對照組水平. 9.血清IL-1β含量變化:心肌炎組小鼠在病毒接種后第1天IL-1β即開始升高,整個病程中均高于正常對照組水平,高峰出現(xiàn)

9、在病毒接種后第5天. 10.相關(guān)分析結(jié)果:心肌組織磷酸化p38MAPK含量和磷酸化ERK含量、血清IL-1β含量之間存在正相關(guān)(r=0.659,0.547,p<0.01,0.019);心肌組織磷酸化ERK含量和血清cTn-I、血清IL-1β含量間存在正相關(guān)(r=0.597,0.518,p<0.01,0.028). 結(jié)論：1.病毒性心肌炎在發(fā)病早期即能誘導(dǎo)p38MAPK出現(xiàn)短暫磷酸化活化,并伴有明顯的核轉(zhuǎn)位,提示p38MA