HBx通過核轉錄因子NF-κB激活趨化因子MIG表達的機制研究.pdf

1、目的：
　　 1.探討HBV是否能誘導肝細胞分泌趨化因子MIG，以及篩選HBV編碼的七個蛋白中能顯著影響MIG表達的蛋白。
　　 2.探討HBx在轉錄水平調控MIG表達的詳細分子機制，篩選出HBx激活的核轉錄因子。
　　 3.探討HBx蛋白誘導的MIG是否具有趨化體外培養(yǎng)活化PBL的生物學功能。
　　 方法：
　　 一. HBV能否誘導肝癌細胞分泌MIG：
　　 1.將包含HBV全基因組的

2、質粒pBlue-HBV轉染肝癌細胞，RT-PCR和ELISA檢測MIG表達變化。
　　 2.將包含了HBV編碼的七個基因的質粒pCMV-S，pCMV-preS1，pCMV-preS2，pCMV-Hbe，pCMV-HBc，pCMV-HBx，pCMV-HBp分別轉染肝癌細胞，RT-PCR和ELISA檢測MIG表達變化。
　　 3.構建包含MIG全長啟動子的報告基因質粒（-983/+33）MIG，與HBV七個基因質粒共轉染肝癌

3、細胞，熒光素酶技術檢測MIG啟動子活性變化。
　　 4.將(-983/+33)MIG與不同劑量pCMV-HBx質粒共轉染肝癌細胞，熒光素酶技術檢測不同劑量的HBx蛋白激活MIG基因啟動子的水平。
　　 二. HBx誘導MIG表達的分子機制：
　　 1.構建系列截短的MIG啟動子報告基因質粒(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG，與pCMV-HBx共轉染，熒光素酶技術分析

4、MIG啟動子活性變化。
　　 2.分別突變NF-κB兩個結合位點，構建突變質粒NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT，與pCMV-HBx共轉染，熒光素酶技術分析突變MIG啟動子活性變化。
　　 3.將pCMV-HBx與 (-985/+33)MIG共轉染HepG2細胞后，用不同濃度的MG-132（NF-κB抑制劑）處理細胞，檢測MIG啟動子活性變化。
　　 4.將NF-κB亞基p65和p50表達質粒pCMV-p

5、65、pCMV-p50分別與(-495/+33)MIG或者NF-κB2 MUT共轉染HepG2細胞，熒光素酶技術檢測MIG啟動子活性變化，ELISA檢測MIG蛋白表達的變化。將pCMV-HBx轉染HepG2細胞后不同時間點收集細胞，分別提取胞質以及核內的總蛋白，Western Blot實驗檢測p65在核內和核外的表達變化；另外，采用FITC標記的二抗處理和DAPI染細胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察p65在胞漿和核內表達變化。
　　

6、5.將pCMV-HBx或pCMV-tag2轉染HepG2細胞后，獲得細胞核抽提物，用濃度為標記探針100倍的未標記探針作為競爭劑進行競爭實驗，EMSA和ChIP實驗驗證NF-κB是否能直接與MIG啟動子上NF-κB位點結合。
　　 三.HBx誘導產生的MIG對體外培養(yǎng)淋巴細胞的趨化作用：
　　 1.將pCMV-HBx和空載體pCMV-Tag2分別轉染HepG2細胞，48 h后分別取細胞分泌上清，通過趨化實驗檢測分泌產物對

7、PBL遷移的影響。
　　 2.將pCMV-HBx轉染HepG2細胞后，加入10μM MG-132處理細胞，取細胞分泌上清，通過趨化實驗檢測分泌產物對PBL遷移的影響。
　　 3.將pCMV-p65、pCMV-p50分別轉染HepG2細胞，或將pCMV-p65、pCMV-p50共轉染HepG2細胞，取細胞培養(yǎng)上清通過趨化實驗檢測各組細胞分泌產物對PBL遷移的影響。
　　 4.分別轉染pCMV-Tag2、pCMV-H

8、Bx、pCMV-p65、pCMV-p50，或將pCMV-p65、pCMV-p50共轉染HepG2細胞。取細胞培養(yǎng)上清加入10 μg抗MIG的抗體中和MIG表達，然后通過趨化實驗檢測各組細胞分泌產物對PBL遷移的影響。
　　 結果：
　　 一.HBV誘導肝癌細胞分泌MIG：
　　 1.與空載體組相比，轉染pBlue-HBV后肝癌細胞中MIG的mRNA水平顯著上調，分泌的MIG蛋白量顯著增加。
　　 2.HB

9、V七個功能蛋白S，preS1，preS2，Hbe，HBc，HBx以及P蛋白中，僅有HBx蛋白可以明顯地誘導趨化因子MIG表達，S蛋白亦可以輕度激活MIG表達，其他HBV蛋白對MIG表達幾乎沒有任何影響。
　　 3.HBV七個功能蛋白中，僅有HBx蛋白可以明顯地激活趨化因子MIG啟動子活性，與空載體組相比，轉染pCMV-HBx后MIG啟動子活性增加3.45倍；其他蛋白對MIG基因啟動子活性幾乎沒有任何影響。
　　 4.隨著

10、HBx蛋白表達量的增加，MIG啟動子的活性隨之增加。
　　 二. HBx誘導MIG表達的分子機制：
　　 1.分別以共轉染空載體pCMV-Tag2和報告基因細胞內MIG啟動子活性為100％，HBx蛋白激活(-985/+33)MIG的活性達3.64倍，而截短的MIG啟動子(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG活性分別達3.81，4.09，1.30倍。由于截短掉-185－-129后

11、，HBx蛋白對MIG啟動子的激活能力大大降低，因此，初步推斷-185－-129位點在HBx蛋白誘導MIG表達的過程中起重要作用。
　　 2.HBx蛋白可以激活野生型MIG啟動子(-495/+33)MIG的活性達3.48倍，而突變的MIG啟動子NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT和c/eBP MUT活性分別達3.12，1.43，2.78倍。由于突變掉NF-κB2結合位點后，HBx蛋白對MIG啟動子的激活能力大大降低，因此推斷

12、NF-κB2結合位點在HBx蛋白誘導MIG表達的過程中起到重要作用。
　　 3.HBx蛋白可以明顯地激活MIG啟動子活性，但是隨著加入的MG-132量的增加，這種激活現(xiàn)象被明顯的抑制，當MG-132的濃度增加到25 uM時，其誘導作用幾乎消失。
　　 4.與空載體組相比，分別轉染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG啟動子活性分別增高2.6和3.4倍；同時轉染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG啟動子活性增

13、高5.8倍。然而，轉染pCMV-p65和pCMV-p50對突變體NF-κB2 MUT沒有任何作用。轉染pCMV-HBx后，隨著時間延長，p65在核內的量逐漸增多，而在核外的量卻逐漸減少。激光共聚焦結果顯示，轉染空載體pCMV-Tag細胞內NF-κB的p65亞基主要集中在細胞質中，而轉染pCMV-HBx細胞內NF-κB的p65亞基由細胞質轉移至細胞核內。
　　 5.EMSA結果顯示，轉染pCMV-HBx的樣本存在遷移帶，而轉染空載

14、體的樣本未出現(xiàn)遷移帶，說明轉染pCMV-HBx樣本中存在和標記探針結合的蛋白；用濃度為標記探針20倍或100倍的未標記探針作為競爭劑進行競爭實驗時發(fā)現(xiàn)，轉染pCMV-HBx樣本 (lane 3或lane 4)的遷移帶隨競爭劑濃度的增加則明顯減弱，說明與探針結合是特異性的；當樣本轉染pCMV-HBx并加MG-132處理后發(fā)現(xiàn)，隨抑制劑濃度增加，遷移帶則明顯減弱，說明與探針結合的蛋白是NF-κB。ChIP實驗顯示，轉染pCMV-HBx基因的

15、樣本，當加入p65或p50的抗體時，可以通過PCR檢測到包含有NF-κB2結合位點的序列，但不加入任何抗體或者加入兔IgG對照抗體并沒有檢測到目的條帶；而轉染陰性對照質粒pCMV-tag2的樣品，當加入p65或p50的抗體時，也沒有檢測到目的條帶。
　　 三.HBx誘導產生的MIG對體外培養(yǎng)淋巴細胞的趨化作用：
　　 1.轉染pCMV-HBx細胞上清的趨化活性是轉染空載體細胞上清趨化活性的5.19倍，說明HBx誘導產物能

16、增強對活化的人PBL的趨化活性。
　　 2.加入NF-κB的抑制劑MG-132處理細胞后，分泌上清對PBL的趨化活性由5.19倍下降至1.94倍，說明NF-κB在HBx蛋白誘導PBL遷移的過程中起著重要作用。
　　 3.與陰性對照相比，轉染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細胞上清趨化活性分別增加3.2和4.0倍，共轉染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細胞上清趨化活性增加6.9倍。由此可知，p65和p50的

17、過表達可以增加細胞分泌產物對PBL的趨化作用。
　　 4.轉染空載體pCMV-Tag2的細胞加入抗MIG抗體中和分泌的MIG后，對細胞上清對PBL的趨化能力沒有影響，而轉染pCMV-HBx的細胞在加入抗MIG抗體后，分泌上清對PBL的趨化能力明顯地下降。轉染pCMV-p65、pCMV-p50的細胞，以及共轉染p65和p50蛋白真核表達質粒的細胞在加入抗MIG抗體后，分泌上清對PBL的趨化能力均明顯下降。轉染pCMV-HBx的細胞

18、經MG-132處理后，再加入抗MIG抗體處理細胞，其趨化PBL的能力較加對照抗體的細胞對PBL的遷移能力下降并不明顯。由此可知，誘導分泌的趨化因子MIG在PBL的遷移中起著重要作用。
　　 結論:
　　 1.HBx蛋白顯著激活趨化因子MIG啟動子活性，從而上調MIG mRNA和蛋白表達的量。
　　 2.HBx蛋白能激活NF-κB，使NF-κB從細胞質轉移至細胞核中，進入細胞核的NF-κB可以結合在趨化因子MIG啟