hCGβ-CTP四聚體與C3d片段融合蛋白的表達、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盤滋養(yǎng)層細胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，在早期妊娠中起促進胚泡發(fā)育、維持妊娠的作用。由于hCG是妊娠期出現(xiàn)的具有時間特異性的激素，因此最初作為避孕疫苗設(shè)計的理想靶分子。hCG疫苗是目前研究最為成熟的一種免疫避孕疫苗，已完成Ⅱ期臨床研究。近年來的研究表明，除了生殖細胞腫瘤如子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌外，大多數(shù)上皮細胞惡性腫瘤也能異位表達hCG類分子，主要

2、以hCGβ形式存在，并隨著腫瘤細胞的進一步增殖擴散，其hCG的表達量會不斷增加，在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移時其表達量達到最高值。研究表明，hCG在腫瘤生長、血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中起重要作用。因此，hCG作為一種腫瘤相關(guān)抗原，其疫苗還可以用于惡性腫瘤的治療。 hCG與糖蛋白激素家族的其他成員促甲狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)具有相同的α亞基，其中hCGβ亞基與LH的β亞基有較高的同源性，兩者前115個

3、氨基酸有82％的同源性。CTP(即hCG羧基端第109-145位氨基酸殘基組成的37肽)是hCG分子所特有，它含有hCGβ的線性表位β<,8>和β<,9>，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有更好的抗原特異性。不足之處是CTP的分子量小，免疫原性差，產(chǎn)生的抗體中和完整hCGβ分子的能力低。 C3d是補體C3的裂解片段，其受體CR2是140 kD的糖蛋白，分布于B細胞、濾泡樹突細胞和一些T細胞。C3d與抗原共價連接后，通過其特異性受體CR2將信號

4、提供給免疫細胞，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。許多研究表明，抗原與3拷貝的C3d連接后在蛋白免疫或基因免疫時可以大大增強該抗原免疫原性。C3d分子作為一種新型分子佐劑引起研究者的關(guān)注。 本研究室前期工作已在畢赤酵母和大腸桿菌中成功地表達了CTP二聚體、三聚體、四聚體，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體，證明了hCGβ-CTP多聚體產(chǎn)生的抗體滴度高于單體產(chǎn)生的抗體滴度。 為了進一步提高hCGβ-CTP多聚體的免疫原性，簡化疫苗的制備工藝，我們

5、在重組的hCGβ-CTP多聚體的基因上連接了分子佐劑C3d基因的三聚體，構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pPIC9Khis6(CTP)n和pPIC9Khis6(CTP)n(n=3，4)3C3d，在畢赤酵母細胞GS115中篩選得到含高拷貝目的基因的克隆并表達目的蛋白。重組蛋白中加入了分子佐劑C3d三聚體，不需要在蛋白表達純化后再次偶聯(lián)化學(xué)佐劑，簡化了疫苗的制備工藝。但是我們發(fā)現(xiàn)，雖然我們采用的是畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒pPIC9K，但是蛋白并沒有分泌到培

6、養(yǎng)上清中，而在酵母胞內(nèi)表達。蛋白的胞內(nèi)表達、酵母破壁困難、低表達量、背景蛋白多以及非變性條件下his-tag不能與Ni-NTA-Sepharose結(jié)合等給純化帶來了很大困難。由于蛋白表達量較低，胞內(nèi)背景蛋白較多，經(jīng)過幾步純化，蛋白純度有所提高，但要得到一定量的蛋白供后續(xù)實驗有困難。原核表達系統(tǒng)遺傳背景清楚，具有成本低、周期短、易操作及表達量高的特點，我們利用原核表達系統(tǒng)對目的蛋白進行了表達。考慮到目的蛋白分子量比較大，表達可能存在困難，

7、構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET=28a(+)-(CTP)<,4>-3C3d和pGEX4T-2-(CTP)<,4>-3C3d，觀察蛋白在兩種表達載體中的表達情況，但表達不理想，這可能與蛋白分子量太大有關(guān)，因為僅3C3d的分子量就可達105 kD。 通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)來源于C3d分子第1209-1236位氨基酸的P28肽段，在體外可以與CR2陽性的Raji細胞結(jié)合，并可被C3d分子競爭性抑制及CR2單抗特異阻斷，認為P28肽含有CR2的結(jié)

8、合位點。有研究表明來源于該區(qū)域的P16肽可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強的抗CEA抗體。含不同拷貝C3d-P28編碼基因的重組質(zhì)粒進行基因免疫，能不同程度地增強HBV-preS2/S誘導(dǎo)的特異性體液免疫及其蛋白加強后的回憶反應(yīng)，其中4拷貝C3d-P28的增強作用較為顯著。因此，我們以P28代替C3d，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pET-28a(+)-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>，一方面大大減小了融合蛋白的分子量，利于表達，另一方面研究C3d-P2

9、8對偶聯(lián)抗原的免疫作用。 我們對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，通過Ni-NTA-Agarose和凝膠過濾方法純化蛋白，得到純度較高的融合蛋白。Bradford方法定量蛋白，相同分子數(shù)的蛋白免疫BALB/c雄性小鼠，共分為三組，Ⅰ組直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>免疫，Ⅱ組用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>加弗氏佐劑免疫，Ⅲ組直接用蛋白hCGβ-(CTP)<,4>-(C3d-P28)<,4>免疫，制備了多克隆抗體。常規(guī)ELISA間接法