bFGF對前脂肪細胞的體外培養(yǎng)、在體移植和自體脂肪微粒注射的作用研究.pdf

1、背景：軟組織在維持面部和軀體輪廓中起著重要作用，軟組織缺損的修復重建目前仍然是整形外科面臨的挑戰(zhàn)之一，嚴重的深度燒傷，腫瘤切除術后，半側顏面萎縮等先天性缺損疾病等都存在軟組織缺損的問題。其中脂肪組織缺損是其主要表現(xiàn)之一。自Neuber在1893年完成了第1例用多個自體游離的小脂肪塊填充軟組織缺損的脂肪移植手術取得滿意的療效后，到20世紀初脂肪移植手術甚為流行。因此項技術操作簡單，不需附加切口，不留瘢痕，組織相容性好，所以在整形及美容外科

2、的許多方面得到廣泛的應用.但是因為存在著脂肪細胞成活率低，較高的吸收率和纖維化問題，臨床效果并不理想.另外脂肪移植后的吸收率的檢查缺乏一個客觀的標準。 對前脂肪細胞性質(zhì)的認識為將脂肪視為可移植的組織材料奠定了堅實的基礎。前脂肪細胞不含脂滴，體積小，有促血管生成特性，在細胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細胞更能耐受缺血與創(chuàng)傷，在脂肪移植后的缺血期，使單個細胞比塊狀脂肪更易通過細胞融合而成活.如果我們利用現(xiàn)有的理論，首先得到患者的前

3、體脂肪細胞，然后在體外促進其增殖分化成成熟的脂肪細胞，就可以隨時用它來填充自身的軟組織缺損。這就等于建立了一個無限量的脂肪組織庫，我們可以根據(jù)需要隨時取貨。目前對人前脂肪細胞的生物學特性還處于研究階段。 目的： 1、通過臨床研究建立一個客觀脂肪移植成活率的影象學判斷標準，并借此觀察臨床bFGF對注射脂肪成活率的作用； 2、觀察bFGF對體外培養(yǎng)的前脂肪細胞增殖和分化的影響。 3、觀察bFGF對移植于裸鼠體

4、內(nèi)前脂肪細胞成脂的影響。為脂肪細胞移植的臨床應用開辟一條新的思路。 方法： (一)1、無菌條件下抽吸的脂肪組織消化、用酶消化法，體外分離培養(yǎng)Pra，并進行傳代擴增；觀察細胞形態(tài)。 2、將第二代細胞按104個/孔(含100μ1培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組，每組3x8孔，其中1組為對照)，實驗組加入生長因子(bFGF10ng/ml)，每天以MTT法觀測細胞增殖情況，繪制生長曲線。 3、將第二代細胞按10

5、4個/孔(含100μl培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組，每組3×8孔，其中1組為對照)。培養(yǎng)2天待細胞融合后后加入分化培養(yǎng)基，實驗組加入生長因子(bFGF10ng/ml)，對照組為僅含10％小牛血清的人前脂肪細胞分化培養(yǎng)液。測定脂肪細胞甘油三酯的合成量。 4、統(tǒng)計學方法處理。 (二)1、制備前脂肪細胞懸液：第二代前脂肪細胞以3×104/ml密度接種培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)，第2天，換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，胰酶

6、消化，以普通培養(yǎng)液制成3x104/ml細胞懸液，分成兩組，A組內(nèi)含10ng/ml重組人bFGF；B組不含重組人bFGF。 2、ADM用15％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡24h待用。 3、細胞生物支架復合體的制備：將經(jīng)15％胎牛血清：DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡過的片狀生物支架置于培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1片，共12孔。實驗分為三組，每組4孔，a組加入A組細胞懸液100μl；b組加入B組細胞懸液100μl；c組加入不含細胞的普通

7、培養(yǎng)液100μ1.各組液體由移液槍均勻滴在ADM表面，靜置10分鐘。 4、細胞支架復合體植入裸鼠皮下，8周后取材。 5、組織學檢查：將上述標本材料經(jīng)10％中性甲醛固定后，石蠟包埋并切片，HE染色，觀察其組織學變化。 6、在200倍光鏡下，每張切片選5個視野，記數(shù)生成脂肪細胞數(shù)目，取平均植(x±s表示)代表脂肪密度，比較三組間差異。 7、免疫組織化學檢查鑒定脂肪組織來源。 (三)1、2006年1月-

8、2007年1月，選取女性雙側顳部凹陷要求手術者20例行顆粒脂肪注射填充術。 2、自體脂肪顆粒的制備：采用注射器針式吸脂法(16號針頭)，于皮下脂肪層放射狀吸取足量脂肪混懸液，過濾、沖洗，每20ml脂肪顆粒中注入堿性成纖維細胞生長因子2000U及慶大霉素8000U，混勻備用。 3、脂肪顆粒的注射：注射總量約為預測脂肪量×150％+局部浸潤麻藥量。 4、注射手術結束后第二天、三月分別照相，CT成像。 5、3月

9、后技算脂肪吸收率，判斷療效。 結果： (一)1、重組人bFGF對前脂肪細胞有明顯的促增殖作用，與對照組比較第1，2天差異不明顯，隨時間的推移，第6-7天到達高峰，與對照組比較差異顯著；bFGF刺激前脂肪細胞倍增時間提前12小時。 2、加入bFGF(10ng/ml)的前脂肪細胞分化提前，細胞內(nèi)合成的脂肪小滴更多；誘導分化第3天時，前脂肪細胞中甘油三酯總量輕度升高，到分化6天和9天時，甘油三酯總量明顯升高，與對照組相

10、比差異均有顯著性。 (二)1、8周后取材的細胞支架復合體HE染色顯示 (1)c組，在裸鼠皮下，脫細胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)都沒有觀察到脂肪細胞； (2)b組，在裸鼠皮下，脫細胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)有脂肪細胞存活，但脂肪細胞散在，密度較a組低； (3)a組，成活的脂肪細胞較多，在真皮表面有成團的脂肪細胞，脂肪細胞可深入真皮內(nèi)。在放大200倍鏡下a組脂肪細胞的數(shù)目(77±56/視野)較b組(66±44/

11、視野)增加明顯。支架內(nèi)有新生血管形成。 2、免疫組化顯示a、b組組都有陽性細胞染色，證明存活的脂肪細胞是人源性的。A組陽性細胞較b組陽性細胞多，c組無陽性細胞染色。 (三)1、本組20例40個凹陷部位，每部位每次脂肪顆粒注射量10ml～16ml，平均11ml術，后無感染、血腫、脂肪液化、脂肪栓塞發(fā)生，1-3月內(nèi)均可見移植物部分吸收體積變小，3個月后外形基本穩(wěn)定。一次注射后優(yōu)16個部位(40％)，良20個部位(50％)，差

12、4個部位(10％)。 2、CT檢測3月后注射脂肪吸收率27％±5.6％ 結論： 1、bFGF對體外培養(yǎng)的前脂肪細胞的有明顯的促增殖分化作用。 2、bFGF對移植于裸鼠體內(nèi)的人前脂肪細胞有明顯的促成脂作用。其可能原因為bFGF促進了脂肪細胞的在體內(nèi)的增殖和分化；bFGF縮短了移植組織內(nèi)形成血管的時間，使移植的脂肪細胞縮短了體內(nèi)缺血缺氧的時間，有更多的脂肪細胞存活。 3、脫細胞異體真皮是一種良好的脂肪