NF-κB抑制劑在破骨細胞生成和骨吸收中的作用.pdf

1、人工關節(jié)置換術是治療各種關節(jié)疾病終末期病變最普遍而有效的方法，但隨著假體使用時間延長，假體發(fā)生松動，失敗率不斷上升。過去一般將這種假體松動單純歸咎于假體與骨界面間的密貼欠佳、假體安裝位置不良、骨水泥碎裂等力學原因。但近年來人們認識到：人工關節(jié)后期松動除上述因素外，主要與假體長期磨損或離解產(chǎn)生的顆粒所誘導的生物學反應有關。生物學反應過程包括：
　?、倌p顆粒的產(chǎn)生；
　　②假體-骨界面間異物反應膜的形成；
　　③破骨細胞

2、性骨溶解，導致假體的骨性支持結構力學性能下降。
　　尤其是破骨細胞性骨溶解的作用被認為意義重大。因此，研究破骨細胞性骨溶解對預防假體松動具有十分重要的意義。
　　RANKL／RANK／NF-κB被認為是介導破骨細胞分化成熟的最重要的信號通路。目前發(fā)現(xiàn)破骨細胞內(nèi)與RANKL相關的信號轉(zhuǎn)導通路主要有四條：NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路。其中NF-KB通路被認為是對磨損顆粒誘導破骨細胞激活發(fā)

3、揮最重要的作用。NF-κB抑制劑包括：PDTC(二硫代氨基甲酸吡咯烷，Pyrrolidine dithiocarbamate)，NAC（N－乙酰半胱氨酸，N-acetylcysteine）等。早期研究已證明PDTC及NAC對NF-κB激活有專一抑制作用。它們抑制NF-κB激活的機制是通過抑制I-κB（靜止細胞中在胞漿內(nèi)與NF-κB結合，阻止其進入細胞核發(fā)揮作用）降解，使NF-κB不能轉(zhuǎn)入細胞核中與其相應耙基因的啟動子結合，從而不能通過啟

4、動或調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)破骨細胞的分化，功能。
　　本研究是采用聚甲基丙烯酸甲脂（Polymethylmethacrylate，PMMA）顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解的動物模型體系，通過Micro-CT掃描后三維重建分析多項數(shù)據(jù)；HE染色、TRAP染色后進行圖像分析，探討NF-κB抑制劑對體內(nèi)破骨細胞骨溶解功能的作用及對局部骨溶解的影響。為闡明NF-κB抑制劑對關節(jié)置換術后骨溶解的防治作用奠定新的理論基礎。具體內(nèi)容如下：
　　1.

5、小鼠顱骨骨溶解模型的建立：2％戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后輸液膠布固定四肢及頭部，新潔爾滅酊消毒頭部皮膚，在顱骨正中矢狀縫位置切開頭皮，切口約0.5cm長，用骨刀刮除骨膜，移液管滴入PMMA顆粒懸液（30mg：0.1ml），4-0號線縫合頭部皮膚。術后小鼠籠內(nèi)自由活動。自術后第二天起每日給予小鼠腹腔注射藥物，術后2周處死。
　　2.Micro-CT掃描后應用eXplore MicroView分析軟件進行三維圖像重建，并分析顱骨標本的

6、BMC、BMD、BVF、CA、CMT五項數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)各項指標整體趨勢大致相同。所有分析結果均表明，PDTC、NAC組比生理鹽水對照組的骨密度、骨礦含量均有明顯增高，用藥后骨骼的硬度力學性能均有相應改善。兩藥物組BVF比對照組明顯增大，說明骨吸收作用被抑制。CA及CMT分析也顯示藥物組皮質(zhì)骨厚度比對照組增厚，皮質(zhì)骨面積與對照組比較明顯增大。這些指標都證明了藥物對骨吸收有明顯的抑制作用。說明藥物對顆粒誘導的骨溶解有明確的抑制作用。

7、　　3.制備組織切片并染色
　　3.1、HE染色，TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色。所有組織測量均使用OsteoMeasure Analysis System，使用顯微鏡分別放大50×，100×，拍攝圖片后進行骨組織計量學分析。指標包括：
　?、偃芙饷娣e百分比OA(Percentage of Osteolytic area)，OA越大表明骨溶解效應越明顯；
　?、谄乒羌毎麛?shù)目ON(Osteo-clast number

8、)，ON越大表明破骨細胞越多，引起骨溶解效應越大。
　　結果發(fā)現(xiàn)：生理鹽水對照組OA最大，顯示骨溶解作用最明顯。NAC藥物組比PDTC藥物組OA更明顯。PBS對照組骨溶解效應最弱。各組骨溶解面積百分比有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05），t檢驗分析兩藥物組間差異明顯（P<0.05）。說明PDTC比NAC有更強的骨溶解抑制作用。生理鹽水對照組破骨細胞數(shù)目ON最多，PBS組ON最少，兩藥物組ON居中，然而經(jīng)t檢驗比較后發(fā)現(xiàn)NAC組與PDT

9、C組間差異不顯著（P>0.05）。
　　3.2、免疫組化染色NF-κBp65表達陽性的IOD(積分光密度)。NF-κBp65的含量越多IOD值越大。分析結果顯示：PBS對照組NF-κBp65表達最弱，生理鹽水對照組NF-κBp65表達最強。One-way ANOVA分析結果顯示四組IOD值之間有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。PDTC組比NAC組NF-κBp65表達更弱，說明兩種藥物對NF-ΚBp65有抑制作用，而且PDTC的抑制作用