靶向MMP-2的RNAi抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測胰腺癌組織中金屬基質(zhì)蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)的表達(dá)及其臨床意義。構(gòu)建靶向MMP-2基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒載體，研究RNA干擾(RNA interference，RNAi)對胰腺癌PANC-1細(xì)胞MMP-2基因、蛋白表達(dá)以及細(xì)胞侵襲行為的抑制作用，為將來進(jìn)一步研究胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制以及抗胰腺癌侵襲治療提供基礎(chǔ)

2、。 方法：利用免疫組織化學(xué)方法檢測36例胰腺癌組織和14例正常胰腺組織中MMP-2蛋白的表達(dá)情況，比較兩組間的差異，從而分析MMP-2的表達(dá)與胰腺癌臨床特征的關(guān)系。設(shè)計(jì)一對針對MMP-2基因的siRNA，并根據(jù)該序列合成兩條小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)的DNA模板單鏈，正義模板鏈兩端分別設(shè)計(jì)加上兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。退火形成siRNA載體插入片段。用限制性內(nèi)切酶將siRN

3、A空載體線性化，T4連接酶將插入片段連接到siRNA空質(zhì)粒中。經(jīng)PCR和測序的方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。通過陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000將重組質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中。以綠色熒光蛋白(GFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，G418篩選挑取陽性單克隆細(xì)胞培養(yǎng)8周。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chai

4、nReaction，RQ-PCK)檢測MMP-2 mRNA表達(dá)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測MMP-2基因在蛋白水平的表達(dá)變化：Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MMP-2基因被干擾后對PANC-1細(xì)胞侵襲能力的影響；MTT比色法檢測PANC-1細(xì)胞增殖活性。 結(jié)果： (1)36例胰腺癌組織中MMP-2陽性率66.7％，正常胰腺組織中MMP-2陽性率14.3％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-2的陽性表達(dá)

5、率與胰腺癌臨床分期有關(guān)，但與胰腺癌的分化程度無關(guān)。(2)經(jīng)PCR及測序鑒定證實(shí)靶向MMP-2基因的siRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。(3)經(jīng)G418篩選挑取陽性單克隆細(xì)胞，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率最高達(dá)82.1％。(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后，MMP-2基因mRNA水平被有效地抑制，干擾效率為71.74％；MMP-2蛋白的抑制效率為49.82％。免疫細(xì)胞化學(xué)染色對照組MMP-2呈強(qiáng)陽性染色，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組MMP-2呈弱陽性染色。(

6、5)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力抑制率達(dá)33.0‰MTT比色法顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，細(xì)胞的增殖活性無明顯變化(P＞0.05)。 結(jié)論胰腺癌組織MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，MMP-2的陽性表達(dá)率與胰腺癌臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，而與胰腺癌的分化程度無關(guān)。體外成功構(gòu)建了靶向MMP-2的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體并有效轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞。靶向MMP-2的siRNA表達(dá)質(zhì)粒能有效抑制胰腺癌PANC-1細(xì)