體外誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有無限或永生的自我更新能力的細(xì)胞，能產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞。在個(gè)體發(fā)育的不同階段及成體不同組織中均存在著干細(xì)胞，來源于各種組織的成體干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中能分化為其他類型的細(xì)胞，即成體干細(xì)胞具有可塑性。 人外周血單個(gè)核細(xì)胞包括單核細(xì)胞、干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，通過密度梯度離心法，收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用單核細(xì)胞可粘著于塑料培養(yǎng)器皿表面的特性，可去除未貼壁細(xì)胞，進(jìn)一步純化單核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m

2、acrophage colony stimulating factor，M-CSF)可促進(jìn)單核細(xì)胞增殖分化，白細(xì)胞介素—3(interleukin-3，IL-3)可促進(jìn)單核細(xì)胞分化及多能干細(xì)胞自我更新。這兩種因子的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)單核細(xì)胞的可塑性具有協(xié)同作用，可使外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生部分未分化，具有重新分化能力并對(duì)刺激它們終末分化的因子反應(yīng)下調(diào)，使這些單核細(xì)胞來源的細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞成為可能。 細(xì)胞的分化和再生受細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子

3、的控制，在大多數(shù)的研究中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growthfactor,TGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)應(yīng)用最多。曾有報(bào)道，在研究多潛能人祖細(xì)胞(hMAPCs)轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)時(shí)，分析比較了多種細(xì)胞因子的作用，如FGF、白

4、血病抑制因子(1eukaemia inhibitory factor，LIF)、HGF、制瘤素M(oncostatin M,OSM)、EGF等，得出在HGF和FGF-4存在的情況下分化為肝樣細(xì)胞的培養(yǎng)條件較好。 目前對(duì)急性或晚期肝病引起的肝功能衰竭，最佳治療方法是肝移植，原位肝移植由于供體器官緊缺，其應(yīng)用受到限制。采用細(xì)胞移植技術(shù)來修復(fù)、治療終末期肝病患者，幫助患者度過危險(xiǎn)期等待肝移植或者直接修復(fù)衰竭肝臟，是一個(gè)理想的方法，因此

5、尋找合適的肝細(xì)胞來源備受關(guān)注。外周血有收集方便、供體不需要麻醉、無骨髓穿刺痛苦、易于患者接受等優(yōu)點(diǎn)，因此用外周血干細(xì)胞移植的方法來獲得轉(zhuǎn)分化后的肝樣細(xì)胞，其臨床應(yīng)用前景非常突出。 目的：探索人外周血單個(gè)核細(xì)胞在HGF及FGF-4誘導(dǎo)下分化為肝樣細(xì)胞的可行性。 方法： 1．采集正常健康志愿獻(xiàn)血者的外周血，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。 2．用RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，去除未

6、貼壁細(xì)胞。 3．在含10％胎牛血清、140uM β-巰基乙醇、5ng/ml M-CSF、0.4ng/ml IL-3的RPMI1640培養(yǎng)液中對(duì)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)6天。 4．6天后，用含10％胎牛血清、20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，即對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞總共培養(yǎng)約26天。 5．觀察細(xì)胞培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化，加入HGF、FGF-4誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的第6、10、14

7、、20天采用免疫熒光法檢測(cè)肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．剛分離的單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)上呈較為均一的圓形，臺(tái)盼蘭染色法測(cè)定活細(xì)胞率>95％，培養(yǎng)2小時(shí)后去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞形態(tài)呈毛毛糙糙的圓形。 2．在M-CSF、IL-3存在的條件下，對(duì)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)6天后，可見細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞趨向融合。未用M-CSF、IL-3培養(yǎng)或單用M-

8、CSF培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁伸展，培養(yǎng)2周后大部分呈纖維樣或梭形，少部分呈圓形。 3．加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后4天左右，可見部分細(xì)胞體積變大，向類圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，類圓形細(xì)胞比例增加。培養(yǎng)20天后，細(xì)胞數(shù)量較未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前減少。未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞，隨培養(yǎng)時(shí)聞的延長(zhǎng)，部分細(xì)胞貼壁伸展，培養(yǎng)20天后大部分呈梭形或纖維樣，少部分呈圓形。 4．實(shí)

9、驗(yàn)組加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后第6、10、14、20天免疫熒光法檢測(cè)AFP均為陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前及對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)檢測(cè)日期免疫熒光法檢測(cè)AFP均為陰性表達(dá)。 5．實(shí)驗(yàn)組加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后第10、14、20天免疫熒光法檢測(cè)ALB均為陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前及對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)檢測(cè)日期免疫熒光法檢測(cè)ALB均為陰性表達(dá)。 結(jié)論：外周血單個(gè)核細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下具有