Survivin反義寡核苷酸對肝細胞癌細胞中Survivin基因表達的影響.pdf

1、背景：肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性程度高、侵襲力強、預(yù)后差、病死率高。因此研究肝細胞癌的發(fā)病機理以及探討新的可行的治療方案具有極其重要的臨床意義。近年來關(guān)于肝細胞癌的治療方案日趨完善，其中反義核酸技術(shù)作為一項新的基因治療方式和途徑受到人們的廣泛關(guān)注。反義核酸技術(shù)的主要作用機制是反義核酸能與mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，從而特異性地封閉靶基因，進而影響和調(diào)節(jié)

2、靶基因的表達。 生存素(survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的新成員?？勺钄嗉毎牡蛲觯谀[瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。survivin僅特異性地表達于多數(shù)惡性腫瘤組織中，而在相應(yīng)正常成人組織中幾乎不表達，這種選擇性表達特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。 目的：本研究通過利用反義核酸技術(shù)原理，設(shè)計合成survivin反義寡核

3、苷酸(survivinASODN)，并將其轉(zhuǎn)染于肝細胞癌SMMC-7721細胞，檢測survivin基因蛋白的表達情況，探討利用反義核酸技術(shù)將survivinASODN轉(zhuǎn)染于SMMC-7721細胞中對survivin基因及蛋白表達的影響，進而為肝細胞癌的基因治療開辟新的途徑，并為之提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 方法：1設(shè)計合成特異性survivinASODN及相應(yīng)的正義對照寡核苷酸(survivinSODN)，應(yīng)用Oligofect

4、amineTMReagent脂質(zhì)體介導(dǎo)，以高表達survivin基因的SMMC-7721細胞為靶細胞，將不同濃度的反義寡核苷酸及正義寡核苷酸作為阻斷劑對靶細胞進行轉(zhuǎn)染，48h后收集細胞。 2提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測轉(zhuǎn)染后各不同濃度轉(zhuǎn)染組及各對照組中survivinmRNA表達的變化。以β-actin作為內(nèi)參照標準，對擴增產(chǎn)物通過凝膠掃描儀進行DNA電泳條帶的光量子強度分析，將surviv

5、in與β-actin比值作為survivinmRNA表達水平的參數(shù)，對survivin產(chǎn)物相對定量。 3采用流式細胞學技術(shù)(FCM)，檢測不同濃度的survivinASODN對SMMC-7721紐胞中survivin蛋白表達的影響。 結(jié)果：1倒置熒光顯微鏡下可見，以O(shè)ligofectamineTMReagent為載體的不同濃度各轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)均見到清晰的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率均達到80％，并且隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加，其中10

6、00nmol/L反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率達到80～90％，而在各對照組細胞內(nèi)未見到綠色熒光。 2在SMMC-7721細胞中survivinmRNA表達變化的研究實驗結(jié)果顯示，各不同濃度轉(zhuǎn)染組150nmol/L、500nmol/L和1000nmol/LASODN轉(zhuǎn)染組、1000nmol/LSODN轉(zhuǎn)染組、空脂質(zhì)體組及空白對照組吸光度比值分別為：3.21±0.08，1.42±0.00，0.75±0.01，3.50±0.05，3.5

7、1±0.02和3.47±0.02。其中各ASODN轉(zhuǎn)染組細胞survivinmRNA表達量均低于各對照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，并且隨著ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加而明顯減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。而正義對照組、空脂質(zhì)體組及空白對照組之間相互比較，SMMC-7721細胞中的survivinmRNA表達量差異無顯著性(P＞0.05)。 3survivin寡核苷酸作用于SMMC-7721細胞后，ASODN150nmol/L、500nm

8、ol/L和1000nmol/L轉(zhuǎn)染組、1000nmol/LSODN轉(zhuǎn)染組、空脂質(zhì)體組及空白對照組survivin蛋白FI值分別為：0.90±0.02，0.80±0.03，0.45±0.08，1.19±0.04，1.15±0.04和1.20±0.00。各survivinASODN轉(zhuǎn)染組中survivin蛋白表達量均低于各對照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，并且蛋白水平的表達量隨ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加而明顯減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。而正義對