促紅細(xì)胞生成素治療宮內(nèi)感染致新生大鼠腦白質(zhì)損傷的研究.pdf

1、目的： 早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(whitematterdamage，WMD)被認(rèn)為是腦癱發(fā)生的最主要的危險(xiǎn)因素，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。目前，早產(chǎn)兒WMD的機(jī)制尚不十分清楚，流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明宮內(nèi)感染在早產(chǎn)兒。WMD的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。WMD的病理特點(diǎn)主要是腦白質(zhì)的凝固性壞死，壞死部位出現(xiàn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)化、少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失、髓鞘損傷和軸突損害。近年來(lái)研究認(rèn)為，WMD的發(fā)生與腦內(nèi)細(xì)胞因子的關(guān)系非常密切。細(xì)胞因子能以

2、多種機(jī)制導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷：1．損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘和軸突等；2．通過(guò)誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子而進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞損害；3．介導(dǎo)一氧化氮(nitricoxide，NO)的神經(jīng)毒性作用等。宮內(nèi)感染導(dǎo)致早產(chǎn)兒WMD的機(jī)制可以推測(cè)為由細(xì)胞因子介導(dǎo)的一系列腦組織中各種細(xì)胞和蛋白合成的變化所致。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)在腦和其它臟器中具有促紅細(xì)胞生成以外的其它重要功能。EPO可能作為一種中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病理變化中的保護(hù)性細(xì)胞因子，對(duì)腦內(nèi)的免疫反應(yīng)有保護(hù)作用，這一作用可能通過(guò)影響腦內(nèi)細(xì)胞因子的合成并發(fā)揮生物效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究表明外周靜脈或腹腔內(nèi)注入重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinanthumanerythropoietin，rhEPO)能通過(guò)血腦屏障而直接在腦內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)EPO與腦損傷的關(guān)系及機(jī)制研究主要集中于EPO對(duì)缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，而EPO與早產(chǎn)兒WMD的關(guān)系以及相關(guān)機(jī)制研究目前仍較

4、少。 因此，本研究通過(guò)建立官內(nèi)感染導(dǎo)致WMD的新生大鼠模型，并給宮內(nèi)感染后的新生大鼠腹腔注射一定劑量的rhEPO，觀察rhEPO干預(yù)對(duì)宮內(nèi)感染后的新生大鼠腦白質(zhì)中的2’，3’—環(huán)核苷3’—磷酸二脂酶(2'，3'—cyclicnucleotide3'—phosphodiesterase，CNPase)、神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP

5、)表達(dá)水平的影響；觀察rhEPO干預(yù)對(duì)宮內(nèi)感染后的新生大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)的基因表達(dá)以及NO含量的影響，從細(xì)胞、分子水平來(lái)說(shuō)明EPO對(duì)官內(nèi)感染導(dǎo)致的新生大鼠WMD可能存在的治療作用。該研究將為臨床治療早產(chǎn)兒WMD提供豐富的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)信息及依據(jù)，為今后進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒WMD的防治提供新的途徑。 方法： 1．實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組1(A組)、對(duì)照組

6、2(B組)、宮內(nèi)感染組(C組)、宮內(nèi)感染+rhEPO低劑量治療組(D組)、宮內(nèi)感染+rhEPO中劑量治療組(E組)、官內(nèi)感染+rhEPO高劑量治療組(F組)，每組8只SD孕鼠。對(duì)照組1為正常對(duì)照，對(duì)照組2為胎齡15天的孕鼠左右兩側(cè)官頸內(nèi)備注射生理鹽水0.2mL，官內(nèi)感染組為胎齡15天的孕鼠左右兩側(cè)宮頸內(nèi)各注射大腸桿菌稀釋液0.2mL，宮內(nèi)感染+rhEPO低(中、高)劑量治療組為宮內(nèi)感染母鼠分娩后，新生大鼠于生后即刻腹腔注射1000(30

7、00、5000)IU/kgrhEPO。 2．標(biāo)本采集：按照新生1、3，7日齡分別隨機(jī)選取各組中的新生大鼠經(jīng)斷頭處死，迅速取出腦組織，將腦組織中性甲醛固定、石蠟包埋，或?qū)⒛X組織經(jīng)液氮速凍后-80℃冰箱中保存。 3．實(shí)驗(yàn)方法：應(yīng)用蘇木素—伊紅(hematoxylineosin，HE)染色觀察各組新生1、3、7日齡大鼠腦室周?chē)踪|(zhì)組織病理變化特點(diǎn)。免疫組化染色檢測(cè)各組新生1、3、7日齡大鼠腦組織CNPase、NF和GFAP的表

8、達(dá)，Westernblot檢測(cè)各組新生1、3、7日齡大鼠腦組織CNPase、NF和GFAP的蛋白水平，熒光定量RT—PCR檢測(cè)各組新生1、3、7日齡大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)—α、白細(xì)胞介素(inrerieukin，IL)-1β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophageinflammatoryprotein，MIP)-1α、MIP-1βmRNA和iNOSmRNA的表達(dá)，硝酸還原酶法檢測(cè)各

9、組新生1、3、7日齡大鼠腦內(nèi)的NO含量。 結(jié)果： 1.48只孕鼠活動(dòng)、進(jìn)食均正常，無(wú)1例發(fā)生死亡。孕鼠分娩情況：A組共92只幼鼠，B組共85只幼鼠，c組共84只幼鼠，D組共89只幼鼠，E組共95只幼鼠，F(xiàn)組共78只幼鼠。宮內(nèi)大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤(pán)內(nèi)血管充血、水腫，并見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組的孕鼠子宮及病理檢測(cè)均未見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 2．新生7日齡大鼠腦室周?chē)踪|(zhì)部位HE染色可見(jiàn)：A、B兩組腦白質(zhì)組織結(jié)

10、構(gòu)正常，染色清晰；C、D兩組腦白質(zhì)染色淡，結(jié)構(gòu)稀疏呈篩網(wǎng)狀改變；E組腦白質(zhì)染色偏淡，結(jié)構(gòu)稀疏化程度較C組有所減輕；F組腦白質(zhì)染色清晰，結(jié)構(gòu)稀疏化程度較C組明顯減輕。 3．宮內(nèi)感染后的新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF表達(dá)顯著下降，rhEPO治療使宮內(nèi)感染后的新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF表達(dá)有所上升。C組新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF蛋白水平較A、B兩組均顯著降低，E、F兩組CNPase蛋白水平則較C組顯著升

11、高，F(xiàn)組NF蛋白水平亦較C組顯著升高。宮內(nèi)感染后的新生7日齡大鼠腦組織GFAP表達(dá)顯著上升，rhEPO治療使宮內(nèi)感染后的新生7日齡大鼠腦組織GFAP表達(dá)有所下降。C組新生7日齡大鼠腦組織GFAP蛋白水平較A、B兩組顯著升高，F(xiàn)組GFAP蛋白水平則較C組顯著降低。 4．宮內(nèi)感染后新生1日齡大鼠腦內(nèi)TNF—αmRNA的表達(dá)水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內(nèi)感染后新生1日齡大鼠腦內(nèi)TNF—αmRNA的表達(dá)水平顯著下降。宮內(nèi)

12、感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)IL-1βmRNA的表達(dá)水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內(nèi)感染后新生大鼠1日齡腦內(nèi)IL-1βmRNA的表達(dá)水平顯著下降。宮內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)MIP-1αmRNA的表達(dá)水平顯著升高，高劑量的rhEPO治療使官內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)MIP-1αmRNA的表達(dá)水平顯著下降。宮內(nèi)感染后新生1日齡大鼠腦內(nèi)MIP-1βmRNA的表達(dá)水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內(nèi)感染后新生1

13、日齡大鼠腦內(nèi)MIP-1βmRNA的表達(dá)水平顯著下降。 5．宮內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)iNOSmRNA的表達(dá)水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)iNOSmRNA的表達(dá)水平顯著下降。官內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)NO含量顯著升高，高劑量的rhEPO治療使宮內(nèi)感染后新生1、3日齡大鼠腦內(nèi)NO含量顯著下降。 結(jié)論： 1．宮頸接種大腸桿菌建立的宮內(nèi)感染大鼠模型能導(dǎo)致新生大鼠腦白

14、質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生稀疏化表現(xiàn)，宮內(nèi)感染后新生大鼠的腦白質(zhì)組織存在少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷、軸突損害和反應(yīng)性星形膠質(zhì)化，提示宮內(nèi)感染能夠?qū)е滦律笫骔MD。 2．通過(guò)給宮內(nèi)大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO能夠減輕官內(nèi)感染后新生大鼠腦白質(zhì)出現(xiàn)的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷、軸突損害和反應(yīng)性星形膠質(zhì)化，提示EPO對(duì)宮內(nèi)感染導(dǎo)致的新生大鼠WMD具有一定的治療作用。 3．宮內(nèi)大腸桿菌感染后新生大鼠腦內(nèi)的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1

15、β、MIP-1α和MIP-1βmRNA在生后早期有一過(guò)性表達(dá)增高的特點(diǎn)，提示由官內(nèi)感染導(dǎo)致的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)在WMD的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。 4．通過(guò)給宮內(nèi)大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO可以抑制宮內(nèi)感染后新生大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、MIP-1α和MIP-1βmRNA的一過(guò)性表達(dá)增高，提示在宮內(nèi)感染致新生大鼠WMD的早期炎癥反應(yīng)階段，EPO可能通過(guò)抑制官內(nèi)感染后新生大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子

16、的大量表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)作用。 5．宮內(nèi)大腸桿菌感染后新生大鼠腦內(nèi)iNOSmRNA在生后早期有一過(guò)性表達(dá)增高的特點(diǎn)，并相應(yīng)出現(xiàn)NO含量的一過(guò)性升高，提示iNOS與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO在宮內(nèi)感染導(dǎo)致早產(chǎn)兒WMD的過(guò)程中可能起重要作用。 6．通過(guò)給官內(nèi)大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO可以抑制宮內(nèi)感染后新生大鼠腦內(nèi)iNOSmRNA的一過(guò)性表達(dá)增高和NO含量的一過(guò)性升高，提示在宮內(nèi)感染致新生