金耳子實體多糖的分離純化、結構鑒定、分子修飾和生物活性的研究.pdf

1、金耳（Tremella aurantialba Bandoni et Zang），俗稱腦耳、金木耳，是我國一種稀有的珍貴食用菌和藥用菌，金耳膠質細膩，清潤可口，其滋補營養(yǎng)價值，優(yōu)于銀耳、黑木耳等其他膠質菌，是“三耳”（金耳、銀耳、黑木耳）中的佼佼者，具有化痰、止咳、定喘、調氣、平肝陽之功效，據(jù)文獻報道，金耳多糖主要具有增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗血栓等作用。目前關于金耳的研究主要集中于對金耳的人工馴化、營養(yǎng)成分和生物活性的研究，

2、多糖作為金耳的主要生理活性成分之一，也受到了國內外越來越多的關注，但由于過去多糖技術和分析手段的落后，金耳多糖的化學研究主要集中于對其基本的理化性質、單糖組成和連接位點的分析，多糖的藥理活性研究也主要是關于粗多糖的研究，而對均一多糖的結構分析和生物活性還很少涉及。為了系統(tǒng)地研究金耳子實體多糖的化學結構和生物學特性，本研究對金耳子實體多糖進行了提取、分離純化、結構鑒定、分子修飾和生物活性研究，為合理開發(fā)和利用金耳資源奠定扎實可靠的理論基礎

3、。
　　 1金耳子實體多糖分離純化和理化性質的研究
　　 金耳子實體經乙醇脫脂和熱水抽提得粗提物TAP、TAP經超濾分級得三組分TAPA、TAPB和TAPC，總得率為3.84％，其中TAPA最高，為3.67％, TAPA的多糖含量也比較高，為62.2％。 TAPA經陰離子交換后得到TAPA1-TAPA5五個組分，其中TAPA1的得率在五個組分中最高為31.6％; TAPA1經Sephacryl S-500凝膠層析并經檢測

4、后得到三個均一多糖：TAPA11、TAPA21和TAPA51。三個均一多糖均為白色絮狀樣品，均易溶于水，溫度升高溶解度升高；在常溫和加溫條件下均不溶于二甲亞砜。
　　 2金耳子實體多糖的結構鑒定
　　 通過單糖組成分析、甲基化分析、紅外譜和NMR譜等技術，研究了金耳子實體的2種均一多糖TAPA11和TAPA21的化學結構。
　　 2.1 TAPA11的結構鑒定
　　 均一多糖TAPA11的分子量為1.35

5、×106，單糖組成主要由甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸組成，其摩爾比約為5:4:1，并含有少量葡萄糖、半乳糖醛酸，是一種酸性多糖；甲基化結果表明，甘露糖主要以1,3-、1，2，3-、1，2,3，4-、1，4-和1-連接；木糖主要以1，2-、1,3-、1，4-和1-連接；葡萄醛酸以1.4-連接.由NMR譜進一步分析結果表明，得出TAPA11的四個結構片段為：
　　 [→3)-α-DManp-(1→3-α- D-Manp1→3)－α-D-

6、Munp-(1→)nⅠ
　　 D B A
　　 β-D-Man p-(1→3)-β-D-Xyp-(1-4)－β-D-GluAp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅱ
　　 E K G A
　　 α-D-Man-(1→4-β-D-Xylp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅲ
　　 c H D
　　 β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xylp-(1→4-α-D-Manp-(1Ⅳ

7、>　　 J F D
　　 因此，TAPA11可能的結構為：
　　 β-D-Manp-(1→3）
　　 E|
　　 α-D-Manp-(1→4）β-D-Xylp-(1→4）
　　 C| X|
　　 β-D-Xylp-(1→2)β-D-GlnAp-(1→2)
　　 H| G|
　　 [→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(→]

8、n
　　 |D B A
　　 β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xlp-(1→4)
　　 J F
　　 2.2 TAPA21的結構鑒定
　　 均一多糖TAPA21的相對分子質量為7.6×105，單糖組成和摩爾比為Man:Xyl:GluA=3:3:1，并含有少量Glc和GalA，是一含葡萄糖醛酸的酸性多糖，結合甲基化結果和NMR圖譜分析結果，表明TAPA21的一級結構主要是由以下三個片段組成：<

9、br>　　 →3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→1
　　 A C B
　　 β-D-GluA-(1→3)-β-D-Xyl-(1→2）－α-D-Man-(1→Ⅱ
　　 G D A
　　 β-D-Xyl-(1→2）-β－D-Xyl-(1→4）-α-D-Man-(1→Ⅲ
　　 E F B
　　 片段Ⅰ組成主鏈，是由α-(1→3)糖苷鍵連接的甘露

10、聚糖組成的，Ⅱ和Ⅲ組成側鏈，分別連接于主鏈Ⅰ的2位和4位。TAPA21的一級結構的重復單元可能如下所示：
　　 β-D-Xyl-(1→2)-β-D-Xyl-(1→4）
　　 E F|
　　 β→3)-α-D-Ma n-(1→3)-α-D-Man13)-α-D-Man-(1→ln
　　 |A e B
　　 β-D-GlnA-（1→3)-β-D-Xyl-(1→2)
　　 G D
　　

11、3均一多糖TAPA11的分子修飾的研究
　　 為了進一步提高均一多糖TAPA11的生物學活性及研究多糖的構效關系，對TAPA11進行了衍生化。采用氯磺酸-吡啶法制備了硫酸酯化多糖TAPA11-s，得率為65.25％，利用BaSO4濁度法測得硫酸基含量為2.88％，取代度為0.05；并對TAPA11-s的紅外光譜和核磁共振波譜進行了初步分析，結果均證實了與計算結果相吻合的低取代度；均一多糖溶解于DMSO中以吡啶、乙酸酐為酯化試劑制

12、備了TAPA11的乙?；嗵茄苌颰APA11-ac，得率分別為56％，乙酰基含量為5.81％，取代度為0.23; TAPA11經脫乙?；饔弥频昧薚APA11的脫乙?；苌颰APA11-deac，得率為75％，經測定乙?；亢腿〈染鶠?，表明了通過乙?；饔靡阴；淹耆幻撊ァ?br>　　 4金耳子實體生物活性的研究
　　 分別選擇了小鼠(BALB/C57)脾淋巴細胞、小鼠巨噬細胞RAW264.7、來源于大鼠腎上腺嗜鉻

13、細胞未成熟神經元的細胞系PC12，以脾淋巴細胞的增殖活性、NO的釋放量和H2O2誘導的PC12細胞損傷修復活性三個指標考察了金耳子實體多糖及其衍生物的生物活性。
　　 4.1金耳多糖及其衍生物對刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖作用作用研究
　　 采用不同溶劑對金耳子實體依次提取所得組分四組分TA冷水提（TAP1）、TA熱水提（TAP）、TA草酸銨提（TAP2）、TA堿提（TAP3）對淋巴細胞均有一定的增殖作用，TAP2的活性最低

14、，其他三組分的活性相當，其中TAP1、TAP的刺激增殖的作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關系；四個組分在試驗濃度下的活性均低陽性對照的活性。綜合考慮四個組分的提取得率和提取工藝簡化程度，選擇了TAP做進一步的分離純化的研究材料。粗多糖TAP經超濾后所得三組分中，TAPA和TAPB相比原樣品TAP活性有所提高，TAPA活性提高顯著，且呈一定的劑量依賴性，TAPA在高濃度時刺激淋巴細胞增殖的活性接近于陽性對照的活性。TAPA經陰離子交換層析后所得各

15、組分中，組分TAPA1刺激淋巴細胞增殖的活性隨濃度升高而活性增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。TAPA1經凝膠層析分離得到的三種均一組分TAPA11、TAPA21和TAPA51中，TAPA11的體外免疫刺激活性最好，高于TAPA在相同濃度下的增殖率。三種衍生物TAPA11-s、TAPA11-ac和TAPA11-deac中，TAPA11-s免疫活性最好，在高濃度下刺激淋巴細胞增殖的活性高于陽性對照，說明TAPA11經硫酸酯化可以提高其生物活性。

16、>　　 4.2金耳均一多糖TAPA11及其衍生物對小鼠巨噬細胞株RAW264.7生成NO的影響
　　 TAPA11對RAW264.7產生NO的量在10μg/ml時就出現(xiàn)明顯增加，且與樣品濃度呈劑量-效應依賴關系，50μg/ml時釋放NO的量與陽性對照LPS（1μg/ml）相當；三種衍生物中，乙?；苌颰APA11-ac作用稍明顯，50μg/ml的NO的釋放量達到了214％，但低于陽性對照LPS(1μg/ml)的水平(258.

17、9％)，其次是硫酸化衍生物TAPA11-s,50μg/ml的NO釋放量為185.7％，脫乙?；苌颰APA11-deac最差（50μg/ml的NO釋放量僅為158.7％），結果表明多糖對巨噬細胞RAW264.7產生NO的影響作用有可能不僅與多糖上的取代基有關系，還可能與取代基的含量（或取代度）有關。
　　 43金耳子實體多糖及其衍生物對經H2O2誘導的PC12氧化損傷的修復活性的研究
　　 研究了總提取物TAP、超濾后

18、各組分、陰離子層析交換所得各組分、凝膠層析所得的均一多糖及衍生物對經H2O2損傷的PC12的修復作用。結果表明，樣品TAP、 TAPA、 TAPB、 TAPC、 TAPA1-TAPA5、 TAPA11對經H2O2損傷的PC12細胞的均具有一定的修復作用；乙?；瘶悠稵APA11-ac的修復作用在500mg/mL時的修復率157.63％，與陽性對照NGF的修復率(166.8％)相當，可見乙?；揎椇蟮臉悠放c原樣品TAPA11相比較可以明顯提