乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)對Notchl與Snail的調(diào)控及其功能的研究.pdf

1、早在1970年，Sherlock等人的研究發(fā)現(xiàn)在慢性肝臟疾病和原發(fā)性肝細胞癌患者血清中存在肝炎相關(guān)澳大利亞抗原，由此提示慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染與肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。到1981年，Beasley等人通過對中國臺灣地區(qū)22，707例男性的前瞻性人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)攜帶

2、者較非HBsAg攜帶者罹患HCC的風險高出63倍，由此為HBV感染與HCC發(fā)生的關(guān)聯(lián)提供強有力的證據(jù)。
　　在HBV基因組編碼的所有蛋白中，乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitisBvirusXprotein，HBx)作為一個重要的非結(jié)構(gòu)多功能調(diào)節(jié)蛋白在病毒感染、復制、致病和致癌過程中發(fā)揮重要作用。盡管已有部分研究證實HBx可通過影響細胞本身信號通路來激活癌基因信號在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生(HBV-associatedhepatoear

3、cinogenesis)過程中可能發(fā)揮重要的促進腫瘤發(fā)生的作用，然而對于HBx在HBV相關(guān)肝癌(HBV-associatedhepatocellularcarcinoma，HBV-HCC)發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍有許多不明之處。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)作為一個進化上高度保守的局部信號傳導通路，Notch1信號在肝癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑制腫瘤形成的作用，但是在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生過程中HBx表達與Notch1信號之間的相互作用及其機制仍有待闡

4、明。此外在慢性HBV感染的HCC患者中發(fā)現(xiàn)有較高的腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移率，盡管近年來HBx與HBV相關(guān)肝癌發(fā)生的病理相關(guān)和重要性引起諸多關(guān)注，但是對于HBx在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機制目前不甚明了，而本研究主要圍繞HBx在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制展開。
　　在本研究的第一部分，發(fā)現(xiàn)在正常肝細胞系和肝癌細胞系中表達HBx可下調(diào)內(nèi)源性的Notch1胞內(nèi)活性片段(Notch1intracellulardomain，

5、ICN1)蛋白水平及其下游靶基因的mRNA水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)HBx對Notch1信號通路的負調(diào)控是通過減少Notch1的剪切而不是抑制Notch1轉(zhuǎn)錄或者其配體表達水平來實現(xiàn)的，而且HBx下調(diào)Notch1剪切的作用是經(jīng)由抑制參與Notch1剪切的γ-分泌酶(γ-secretase)的關(guān)鍵組分presenilinl(Psenl)來介導的。通過HBx瞬時轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，在體外細胞培養(yǎng)中HBx可通過下調(diào)ICN1水平來促進肝癌細胞增殖(cell

6、proliferation)、誘導肝癌細胞G1-S期的細胞周期進展(G1-Scellcycleprogression)和抑制細胞衰老(cellularsenescence)。進一步用裸鼠皮下腫瘤移植實驗證實穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx也可經(jīng)由下調(diào)ICN1水平鈍化衰老樣生長抑制(senescence-likegrowtharrest)從而促進肝癌細胞生長和腫瘤形成。最后在HBV相關(guān)肝癌患者腫瘤組織樣本中證實了下調(diào)的Psenl-依賴的Notch1信號和鈍化的

7、衰老樣生長抑制二者之間的相關(guān)性。結(jié)論：這部分研究闡明了HBx在肝癌發(fā)生過程中的一個新功能，即通過抑制Notch1信號活化來鈍化衰老樣生長抑制從而促進腫瘤發(fā)生，該發(fā)現(xiàn)提供了一種可能的HBV相關(guān)肝癌發(fā)生的新機制。
　　在本研究的第二部分，發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中表達HBx可使肝癌細胞形態(tài)從上皮型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型、上皮細胞標志分子下調(diào)(如E-cadherin)、β-catenin的核轉(zhuǎn)位以及間質(zhì)細胞標志分子的上調(diào)(如N-cadherin、vimen

8、tin和fibronectin)，由此提示HBx表達可誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。進一步研究發(fā)現(xiàn)HBx誘導發(fā)生EMT依賴于EMT調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白水平的增加，而Snail蛋白水平的增加是通過HBx表達增強Snail蛋白穩(wěn)定性，而非通過促進Snail轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的，siRNA干擾Snail可以抑制HBx誘導發(fā)生EMT。此外還證實HBx表達通過激活PI3K

9、/AKT/GSK-3β信號通路來增強Snail蛋白穩(wěn)定性，PI3K/AKT信號通路特異性的抑制劑LY294002和Wortmannin處理、以及組成性激活型的GSK-3βS9A突變體共轉(zhuǎn)染均可抑制HBx表達上調(diào)Snail蛋白水平。最后通過體外細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移實驗和Collagen細胞侵襲實驗分析發(fā)現(xiàn)，在體外細胞培養(yǎng)中HBx表達可促進肝癌細胞的細胞遷移(cellmigration)和細胞侵襲(cellinvasio