頭端延髓腹外側(cè)區(qū)過(guò)表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2降低高血壓大鼠中樞交感輸出的機(jī)制研究.pdf

1、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（Angiotensin-converting enzyme2, ACE2）是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的同系物，能夠直接催化血管緊張素Ⅱ（Angiotensin II， AngⅡ）轉(zhuǎn)換為血管緊張素1-7(Ang1-7)，通過(guò)激活Mas受體從而發(fā)揮舒張血管及降低血壓等心血管保護(hù)作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（the rostral ventrolateral medulla，RVLM）在血壓和交感神經(jīng)活動(dòng)調(diào)控方面起到十

2、分關(guān)鍵的作用。交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)是高血壓的主要特征之一，并與其發(fā)展預(yù)后密切相關(guān)。中樞AngⅡ增加是高血壓交感輸出增強(qiáng)的重要原因。此外，高血壓交感輸出增強(qiáng)與 RVLM內(nèi)興奮性機(jī)制的增強(qiáng)密切（如AngII誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和興奮性氨基酸能的突觸傳遞等）相關(guān)。相關(guān)研究證實(shí)在自發(fā)性高血壓大鼠（SHR） RVLM內(nèi)通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)ACE2可以導(dǎo)致一個(gè)長(zhǎng)期的降血壓效應(yīng)，但其機(jī)制尚未明確。因此，本研究目標(biāo)是明確RVLM過(guò)表達(dá) ACE2降低血壓和減弱中樞

3、交感輸出的機(jī)制和途徑。
　　目的：本研究工作通過(guò)在SHR及WKY大鼠RVLM內(nèi)用慢病毒過(guò)表達(dá)ACE2后明確血壓和心率變化；通過(guò)檢測(cè)尿中24小時(shí)去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）含量以明確交感輸神經(jīng)活動(dòng)變化；通過(guò)檢測(cè) ACE2和血管緊張素 II主要作用受體1型受體（AT1R）的表達(dá)變化，明確ACE-AngⅡ-AT1R軸及ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的變化；通過(guò)檢測(cè)通過(guò)過(guò)氧化物歧化酶（superoxide d

4、ismutase,SOD）和NADPH氧化酶的表達(dá)變化，明確ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)活性氧族（reactive oxygen species,ROS）生成和消除以及氧化應(yīng)激影響；通過(guò)檢測(cè)ACE2轉(zhuǎn)染6周RVLM內(nèi)微透析液中谷氨酸（glutamic acid,Glu）濃度，明確RVLM內(nèi)ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)RVLM內(nèi)Glu釋放的影響；通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在大鼠RVLM內(nèi)急性微量注射Glu受體阻斷劑，明確ACE2過(guò)表達(dá)后Glu受體在介導(dǎo)心血管功能調(diào)節(jié)中的

5、作用。通過(guò)以上研究，我們將闡明RVLM過(guò)表達(dá) ACE2增加內(nèi)源性Ang1-7后降低血壓和減弱中樞交感輸出的機(jī)制和途徑。
　　方法：采用慢病毒載體將ACE2（Lenti-ACE2）過(guò)表達(dá)于RVLM，而Lenti-GFP為對(duì)照組（不含目的基因的只表達(dá)表達(dá)綠色熒光蛋白），轉(zhuǎn)染后每周同一時(shí)間段無(wú)創(chuàng)大鼠尾動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)大鼠血壓及心率變化。運(yùn)用高效液相色譜檢測(cè)大鼠24h尿液中NE濃度，以及RVLM微透析液中谷氨酸含量的變化。運(yùn)用western-b

6、lot方法檢測(cè)RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2后ACE2、AT1R、SOD、NADPH氧化酶等蛋白的表達(dá)變化。通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在RVLM內(nèi)微量注射Glu受體阻斷劑，觀察血壓、心率和腎交感神經(jīng)放電變化，以明確Glu受體功能的在介導(dǎo)心血管功能調(diào)節(jié)中的作用。
　　結(jié)果：
　　1．ACE2在RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)血壓和心率的影響
　　RVLM過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)大鼠血壓的影響：轉(zhuǎn)染之前，SHR組與WKY組血壓及心率存在顯著差異（p<0.05）

7、，SHR的收縮壓(SBP，200±11 mmHg),舒張壓(DBP，150±8 mmHg)，平均動(dòng)脈壓(MAP，167±9 mmHg),心率[HR，401±32次/分(bpm)]顯著高于同齡對(duì)照WKY的SBP(160±13 mmHg, DBP(114±11 mmHg)， MBP（126±12 mmHg），HR(357±24 bpm)；轉(zhuǎn)染之前，SHR以及WKY大鼠組內(nèi)轉(zhuǎn)染ACE2組和對(duì)照GFP組之間無(wú)顯著性差異。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-A

8、CE2組第四周的SBP(190±12 mmHg）、DBP（136±9 mmHg）、MAP（151±9 mmHg）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP的SBP（202±11 mmHg）、DBP（149±9 mmHg）、MAP（166±10 mmHg）。SHR分別轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組和Lenti-GFP組轉(zhuǎn)染后前3周HR無(wú)明顯變化，SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2第四周開(kāi)始出現(xiàn)降低，第五周開(kāi)始SHR轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)ACE2組的HR（397±2

9、9 bpm）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染GFP組的HR（435±37 bpm）。
　　2．SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)的影響
　　SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周24小時(shí)尿液中NE排出量（0.367±0.075μg/24h）顯著低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組的（0.534±0.058μg/24h），與正常WKY組（0.426±0.044μg/24h）相比無(wú)差異。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組24小時(shí)尿液中去甲

10、腎上腺素含量高于正常WKY組。
　　3．ACE2在RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)ACE-AngII-AT1R軸的影響
　　SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后ACE2表達(dá)（0.103±0.0047）顯著高于 SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組（0.062±0.0051），與正常WKY組（0.0992±0.0056）相比無(wú)差異。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組ACE2表達(dá)低于正常WKY組。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后AT1R表達(dá)（0.173±0

11、.041）顯著低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組（0.5460±0.061），但仍高于正常WKY組（0.0835±0.0043）。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組AT1R表達(dá)高于正常WKY組。
　　4．ACE2在RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)ROS產(chǎn)生的影響
　　SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組SOD1表達(dá)（0.247±0.044）顯著高于 SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP（不含目的基因的只表達(dá)表達(dá)綠色熒光蛋白）組（0.138±0.053），

12、但仍然低于正常WKY組（0.663±0.046）。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組SOD1表達(dá)遠(yuǎn)低于正常WKY組。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后NADPH氧化酶主要亞基NOX4表達(dá)（0.137±0.023）顯著低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組（0.182±0.034），與正常WKY組（0.143±0.029）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組ACE2表達(dá)高于正常WKY組。
　　5．ACE2在RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)RVL

13、M內(nèi)Glu神經(jīng)遞質(zhì)的影響
　　SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周RVLM微透析液中Glu含量（622±121μg/L）顯著低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組的（1586±285μg/L），但仍然高于正常WKY組（279±145μg/L）。SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組RVLM微透析液中Glu含量高于正常WKY組。
　　6．ACE2在RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)RVLM內(nèi)Glu受體介導(dǎo)的心血管功能的影響
　　RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染6周后

14、 RVLM微量注射谷氨酸受體阻斷劑 Kynurenic Acid（Kyn,2.7nmol）后SHR-ACE2組的MAP降低程度（16±3 mmHg）、HR降低程度（20±4 bpm）、腎交感神經(jīng)放電(RSNA)減弱百分比（16.5.±4.6％）均明顯低于 SHR-GFP組的MAP降低程度（26.7±4.4 mmHg），HR降低程度（30.4±6.7 bpm），RSNA減弱百分比（21.3.±4.6％）。但仍然高于WKY組的MAP降低程度

15、（2.2±1.3 mmHg），HR降低程度（4.64±5.2 bpm），RSNA減弱百分比（3.1±5.4％）。
　　結(jié)論：降低SHR的血壓、心率和交感神經(jīng)活動(dòng)減弱；SHR的RVLM過(guò)表達(dá)ACE2后， RVLM內(nèi)AT1R蛋白表達(dá)下降，AngⅡ-AT1軸的作用被削弱；SHR的RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)ACE2后，SOD1表達(dá)上調(diào)，NOX4表達(dá)下調(diào)，RVLM內(nèi)ROS生成減少，去除增加，氧化應(yīng)激減弱；SHR的RVLM轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后，