TWEAK通過P38MAPK途徑促進(jìn)大鼠心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和MMP-1表達(dá).pdf

1、背景:
　　 高血壓為最常見的慢性病，在其發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中，可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、腦、腎臟等多器官并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著人類健康。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)作為高血壓病心肌損害的主要病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)膠原的過度沉積和肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)數(shù)目的增多，進(jìn)而影響心室壁動(dòng)度及心室的舒張及收縮功能，從而導(dǎo)致嚴(yán)

2、重心律失常、心功能不全及心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，高血壓心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制和防治措施已成為近年來國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)MF是一個(gè)復(fù)雜的病理過程受免疫系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和多種細(xì)胞因子調(diào)控。而炎癥因子作為參與調(diào)控MF的重要因素在其發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　 在諸多的細(xì)胞因子中，TNF超家族作為一個(gè)有多重生物學(xué)效應(yīng)的促炎反應(yīng)因子，與多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。TNF

3、是一組具有多樣生物學(xué)效應(yīng)的促炎反應(yīng)細(xì)胞因子，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。如:TNF-α表達(dá)升高可導(dǎo)致心功能不全及心肌病并且TNF-α還參與糖尿病大鼠心肌炎癥反應(yīng)及纖維化。作為TNF超家族中的新成員腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TWEAK)，于1997年發(fā)現(xiàn)其主要由淋巴樣細(xì)胞表達(dá)，在其合成之初為Ⅱ型膜結(jié)合蛋白，隨后很快被furin酶水解成具有生物學(xué)活性的可溶性的小片段。Fn14主要由非淋巴樣細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，作為

4、TWEAK特異性相關(guān)受體為人們所熟知，是Ⅰ型跨膜蛋白。TWEAK和Fn14廣泛表達(dá)于各種組織及細(xì)胞內(nèi)，在胰腺、腸、心臟、大腦、肺、卵巢及骨骼肌中均有TWEAKmRNA的表達(dá)，在肝臟及腎臟中亦少量表達(dá)。近年TWEAK及其特異性受體Fn14在創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生方面介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)受到越來越多的關(guān)注，TWEAK作為一種促炎及促血管生成的細(xì)胞因子介導(dǎo)多種細(xì)胞的生長、增殖、凋亡，促炎性反應(yīng)和血管生成等作用。研究發(fā)現(xiàn)TWEAK與其受體Fn14結(jié)合主

5、要通過核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)途徑等多個(gè)下游信號通路的瀑布樣反應(yīng)發(fā)揮作用。隨著研究深入，TWEAK與其受體Fn14促進(jìn)AS、MF及介導(dǎo)心肌重塑等在心血管系統(tǒng)過程中所發(fā)揮的的作用越來越得到重視。TWEAK/Fn14能促進(jìn)內(nèi)皮功能不全、增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)

6、平滑肌細(xì)胞增殖及遷移、上調(diào)MMPs表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞死亡，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展，促使其不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致急性冠脈綜合征的發(fā)生。在ST段抬高型急性心肌梗死病人時(shí)血清可溶性TWEAK(sTWEAK)顯著升高，其升高程度與病人的短期預(yù)后密切相關(guān)。在心肌纖維化方面，研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)心肌中Fn14表達(dá)明顯增強(qiáng)，F(xiàn)n14可能參與SHR心肌纖維化的過程，培哚普利可能通過抑制其

7、表達(dá)減輕心肌纖維化。進(jìn)而在體外細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)TWEAK/Fn14明顯促進(jìn)CFs中NF-κB和MMP9mRNA及蛋白表達(dá)，而以PDTC抑制NF-κB通路后，CFs增殖降低且MMP9表達(dá)減少。進(jìn)而揭示TWEAK通過激活經(jīng)典的NF-κB通路能促CFs增殖和膠原合成，參與心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)現(xiàn)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)TWEAK通過激活經(jīng)典的NF-κB通路，促進(jìn)大鼠CFs增殖和Ⅰ/Ⅲ膠原合成，促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展。然而，在心肌纖維化方面相關(guān)研究發(fā)

8、現(xiàn)，TWEAK作為一種具有多種活性的炎癥因子，除能激活經(jīng)典的NF-κB通路外，還可通過介導(dǎo)Fn14激活非經(jīng)典的NF-κB通路以及MAPK通路，然而相關(guān)研究未見報(bào)道。因此，本文通過觀察TWEAK介導(dǎo)P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38MAPK)通路對大鼠心肌成纖維細(xì)胞中膠原代謝影響，及MMP-1表達(dá)的影響，以迸一步明確TWEAK參與心肌纖維化的機(jī)制。
　　 目

9、的:
　　 探討腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TWEAK)影響心肌成纖維細(xì)胞(CFs)中Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）表達(dá)的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.采用胰蛋白酶消化法及時(shí)間差法培養(yǎng)并純化新生Wistar大鼠心肌成纖維細(xì)胞。并采用倒置顯微鏡及波形蛋白免疫熒光法觀察并鑒定心肌成纖維細(xì)胞。
　　 2.加入重組人TWEAK(rhTWEAK

10、)及P38MAPK抑制劑(SB203580)干預(yù)。
　　 將實(shí)驗(yàn)分為:
　　 ①對照組:不加干預(yù)因素;
　　 ②TWEAK組:加入100ng/mLTWEAK;
　　 ③TWEAK+SB203580組:加入100ng/mLTWEAK+SB203580。
　　 3.各實(shí)驗(yàn)組分別采用MTT法檢測CFs增殖;western blot法檢測Ⅰ型膠原蛋白及磷酸化P38MAPK(P-P38MAPK)蛋白表達(dá);q

11、RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá);ELASA法檢測CFs細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-1的濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1.CFs的形態(tài)觀察及鑒定
　　 培養(yǎng)48h后，CFs已長滿或接近長滿單層培養(yǎng)瓶，長滿或接近長滿單層。于倒置顯微鏡下觀察，CFs多呈梭形，無自發(fā)性搏動(dòng)。其細(xì)胞核較大，胞漿透明。采用波形蛋白免疫熒光鑒定，CFs的波形蛋白呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，其胞漿內(nèi)圍繞胞核呈現(xiàn)綠色網(wǎng)絡(luò)狀物質(zhì)。
　　 2.干預(yù)因素對CF

12、s增殖的影響
　　 rhTWEAK干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞48h后，對照組(0.302±0.019)，TWEAK組(0.493±0.042)，TWEAK+SB203580組(0.362±0.039)三者間相比較，TWEAK組較對照組可顯著促進(jìn)CFs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而TWEAK+SB203580組較對照組比較也可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖(P＞0.05)。SB203580干預(yù)組及未干預(yù)組比較，CFs增殖程度降低，差異

13、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.各組對Ⅰ型膠原mRNA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)
　　 以上各實(shí)驗(yàn)組終止干預(yù)后，測定以上各組中Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)分別為TWEAK組(6.080±0.676)，TWEAK+SB203580組(3.400±0.810)。與對照組比較，TWEAK組及TWEAK+SB203580組中Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平明顯增多，差異間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在特異性阻斷P38MAPK通路后，其

14、Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平較TWEAK組降低，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3a。與對照組比較，二者Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯升高差異(P＜0.05)。同TWEAK組相比，TWEAK+SB203580組中Ⅰ型膠原蛋白較其減少42.6％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.各組CFs中P-P38MAPK蛋白的表達(dá)
　　 各實(shí)驗(yàn)組間相比，TWEAK組較對照組及TWEAK+SB203580組，可明顯促進(jìn)CFs中

15、P-P38MAPK蛋白表達(dá)(P＜0.01)。TWEAK+SB203580組與對照組相比，TWEAK+SB203580組部分抑制P-P38MAPK蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　 5.各組CFs中MMP-1的表達(dá)
　　 各實(shí)驗(yàn)組終止干預(yù)后，應(yīng)用ELISA法測定各組心肌成纖維細(xì)胞中MMP-1濃度，TWEAK組較其他兩組明顯上調(diào)CFs中MMP-1表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。TWEAK+SB203580組與TWEAK

16、組相比，部分抑制心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.TWEAK/Fn14可顯著促進(jìn)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖，上調(diào)細(xì)胞中Ⅰ型膠原mRNA及Ⅰ型膠原蛋白和P-P38MAPK蛋白表達(dá)，并促進(jìn)炎癥因子MMP-1表達(dá)。
　　 2.應(yīng)用SB203580后，可部分抑制TWEAK促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖程度，并部分抑制細(xì)胞中Ⅰ型膠原mRNA、Ⅰ型膠原蛋白和P-P38MA