溶藻弧菌HY9901Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的功能研究.pdf

1、弧菌Ⅲ型系統(tǒng)效應(yīng)蛋白對(duì)宿主細(xì)胞具有致病功能，研究效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)功能對(duì)研究其致病機(jī)理和制作疫苗有重要意義。根據(jù)GenBank上面溶藻弧菌的基因序列，設(shè)計(jì)hopPmaJ、 va1686和type3hy3223對(duì)效應(yīng)蛋白基因的引物，PCR擴(kuò)增獲得三個(gè)基因的全長(zhǎng)片段。結(jié)果顯示:hopPmaJ全長(zhǎng)345bp，共編碼114個(gè)氨基酸殘基，生物信息學(xué)分析表明其不存在信號(hào)肽，有蛋白激酶磷酸化等位點(diǎn)，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型為同源二聚體?？寺『蜏y(cè)序分析了va168

2、6和type3hy322基因，va1686全長(zhǎng)為1164bp，為溶藻弧菌效應(yīng)蛋白中的膜通透蛋白基因;type3hy322全長(zhǎng)為969bp，為溶藻弧菌效應(yīng)蛋白中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。在大腸桿菌表達(dá)type3hy322和va1686，得到Type3hy322和Va1686蛋白。
　　通過(guò)對(duì)溶藻弧菌HY9901 hopPmaJ基因的PCR擴(kuò)增、融合，酶切、連接、轉(zhuǎn)化、菌株接合、同源重組和缺失株篩選，成功能構(gòu)建缺失株△hopPmaJ,并對(duì)△ho

3、pPmaJ的生物學(xué)表型特征進(jìn)行了研究，確定突變株具有遺傳穩(wěn)定性。野生株V.alginolyticus HY9901和△hopPmaJ比較，兩者生長(zhǎng)速率一致，HopPmaJ生物被膜形成能力，胞外蛋白酶活性沒(méi)有顯著變化，△hopPmaJ泳動(dòng)能力顯著減低。△hopPmaJ對(duì)斑馬魚(yú)的其半致死量LD50為1.2×108cfu/mL，比野生株下降約有兩個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)△hopPmaJ在魚(yú)體中的生物安全性及其免疫保護(hù)性進(jìn)行了研究。用106cfu/mL浸泡