藤黃微球菌Rpf結構域及其突變體基因的克隆、表達及生物活性的初步研究.pdf

1、結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）所致的、以呼吸系統(tǒng)感染為主的傳染病。近年來，由于卡介苗（BCG）保護性的不完善、耐藥MTB菌株的出現(xiàn)、艾滋病的流行以及人口流動等因素的增加，使得TB的發(fā)病率呈日益上升的趨勢，再次成為危害人類健康的世界性疾病。BCG是目前預防TB的唯一疫苗，但其不能有效預防成人TB，因此，積極研究TB的致病及免疫機制，對于開發(fā)更為有效的診

2、斷、預防和治療TB的新技術具有重要意義。
　　藤黃微球菌（M.luteus）中的復活促進因子（Resuscitation-promotingfactor，Rpf）是第一個被發(fā)現(xiàn)的細菌生長因子，它具有促進休眠菌的復蘇以及促進細菌快速生長的作用。序列對比分析發(fā)現(xiàn)，在其它的一些革蘭氏陽性細菌如MTB、麻風分枝桿菌、藍色鏈霉菌、谷氨酸棒桿菌等中也存在30多個與Rpf同源的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)MTB基因組可編碼5種Rpf樣蛋白，分別為Rv0867

3、C（RpfA）、Rv1009（RpfB）、Rv1884C（RpfC）、Rv2389C（RpfD）和Rv2450C（RpfE），推測這些蛋白也具有促進MTB快速生長的作用。此外，這些蛋白均具有Rpf樣結構域，即高度保守的70aa殘基，該保守區(qū)域對Rpf的復蘇功能是至關重要的，單獨的Rpf結構域具有與Rpf蛋白一致的生物學功能。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Rpf結構域中都有一個高度保守的谷氨酸殘基（glu54），為Rpf活性所必需，與溶菌酶催化活性相

4、符。
　　實驗目的：
　　利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達并純化出M.luteusRpf結構域及其突變體蛋白，并進一步研究其生物學活性。
　　實驗方法和結果：
　　1.Rpf結構域及其突變體蛋白的表達及純化
　　采用聚合酶鏈反應（PCR）從M.luteus基因組中擴增出Rpf結構域及其E54A和E54K兩種突變體基因，用限制性內切酶消化后克隆入pMD-18T載體中，經(jīng)測序證實，與GenBank公布的序列完全相同，

5、突變位點與設定一致。將測序正確的基因分別亞克隆到pGEX-4T-1表達載體中，酶切鑒定陽性重組質粒，轉化大腸桿菌，并用IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE分析表明成功地表達了Rpf結構域及其突變體融合蛋白，用Rpf結構域單克隆抗體（mAb）進行Western-blot分析證實，其大小為32kD，與預計的融合蛋白大小相符。用GS-4B親和色譜柱純化獲得了目的蛋白。
　　2.Rpf結構域及其突變體融合蛋白生物學活性的檢測
　　

6、將恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis，M.S）休眠菌以1：150的比例稀釋。把各種融合蛋白按照不同的濃度加入到M.S休眠菌中，并分別用相應的抗體進行干預。37℃振蕩培養(yǎng)，每4h取少量培養(yǎng)液測A600nm值，根據(jù)測定結果繪制生長曲線圖。結果表明：Rpf結構域蛋白對M.S具有促進復蘇和促生長的作用，使M.S的培養(yǎng)周期縮短。而且Rpf結構域蛋白具有和Rpf蛋白相同的生物學活性。E54K突變后的Rpf蛋白對于M.S的生長

7、有一定的抑制作用，而E54A無明顯的抑制生長作用。
　　結論：
　　獲得了Rpf結構域及其兩種突變體蛋白E54K和E54A，Rpf結構域蛋白與完整的Rpf蛋白一樣對M.S具有一定的復蘇和促生長作用；而加入Rpf及Rpf結構域抗體后，其作用被抵消，使M.S維持正常生長。E54K突變體對于休眠的M.S的生長有一定的抑制作用。E54A對于休眠的M.S無明顯的抑制作用。這些結果為研究Rpf結構域突變體在抑制M.luteus的生長，進