基因comE對肺炎鏈球菌轉化率影響機制的研究.pdf

1、轉化是細菌基因重組最常見的方式之一，轉化的結果可使細菌的染色體整合上外源DNA，從而使其某些生物學特征發(fā)生變化，并能代代遺傳。大量研究證明細菌的轉化與其進化、毒力因子和耐藥性等生物學性狀的表達密切相關。同時轉化也成為實驗室對細菌進行基因改造的一個簡便而重要工具。 肺炎鏈球菌可以在自然生長狀態(tài)下產(chǎn)生感受態(tài)而發(fā)生轉化，即自然轉化；其感受態(tài)也可通過感受態(tài)刺激因子（competence-stimulating peptide，CSP）誘

2、導產(chǎn)生，即誘導轉化。目前調(diào)控肺炎鏈球菌轉化的基本分子網(wǎng)絡已清楚，但肺炎鏈球菌在不同生長階段、不同濃度CSP誘導時的轉化率差別很大，其分子機制尚不清楚。操縱子comCDE是調(diào)控肺炎鏈球菌轉化發(fā)生的關鍵基因，其中comE為該操縱子發(fā)揮作用的效應蛋白，細菌不同轉化率的發(fā)生是否就是該基因表達變化的直接結果呢？我們的研究思路是：首先缺陷基因comE，以驗證基因comE在細菌轉化中的關鍵作用，然后分別探討CSP誘導轉化和自然轉化中不同轉化率的發(fā)生與

3、該基因的相關性，并通過蛋白質(zhì)組學方法初步探索其調(diào)控機制。本研究包括以下三個部分： 1.comE基因對肺炎鏈球菌轉化的影響。構建comE基因缺陷菌株，比較野生菌株和缺陷菌株的自然轉化率及CSP誘導轉化率，結果顯示comE基因缺陷菌株的自然轉化率和CSP誘導轉化率為0，提示基因comE為細菌自然轉化和CSP誘導轉化所必需。 2.探討肺炎鏈球菌在不同生長時間的自然轉化率與comE基因表達變化的相關性。通過熒光定量PCR技術檢測

4、comE基因在細菌不同時期的mRNA表達水平，并測定對應的細菌轉化率。結果顯示細菌在整個生長過程中只有一個轉化率高峰，約在菌密度為A550=0.3左右；而基因comE的mRNA表達則有2～3個高峰期，與細菌不同轉化率的發(fā)生無顯著相關性（r<0.3），提示可能存在基因comE以外的其他因子與細菌的自然轉化率直接相關。 3.探討不同濃度CSP誘導細菌發(fā)生的不同轉化率與comE基因表達變化的相關性。通過熒光定量PCR技術檢測comE基

5、因在不同濃度CSP誘導時、不同時期的mRNA表達水平，并測定對應的細菌轉化率。結果顯示（1）comE的mRNA表達水平在100μg/L CSP誘導后10min顯著上升，之后迅速下降，其轉化率與其comE的基礎表達顯著相關（r>0.99），提示在該CSP濃度下，細菌的不同轉化率發(fā)生與comE的基礎表達量相關。（2）10μg/L、100μg/L和1000μg/L的CSP誘導轉化時，細菌的轉化率沒有隨其濃度的增加而升高，comE只在100μg

6、/L的CSP誘導時表達量增加，表明細菌不同轉化率發(fā)生及comE的誘導表達量變化與CSP不存在明顯濃度依賴性，提示存在CSP以外的其他因子調(diào)控基因comE的表達及細菌的轉化，且可能存在基因comE以外的其他因子與細菌的轉化率直接相關。 為了探尋細菌轉化可能的調(diào)控機制，我們應用蛋白質(zhì)組學技術（雙向電泳結合MALDI-TOF-MS）對肺炎鏈球菌感受態(tài)發(fā)生到關閉這一時間段內(nèi)表達的蛋白質(zhì)進行比較，從蛋白水平分析了其發(fā)生不同轉化率的分子機制