Notch信號與BLM誘導大鼠肺纖維化.pdf

1、背景
　　肺微血管內皮細胞（Pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）是肺氣血屏障的重要組成結構，生理情況下維持人體正常的呼吸交換功能，其功能變化對維持血管正常結構以及肺組織損傷后的修復起重要作用。在肺纖維化（Pulmonaryfibrosis，PF）的形成過程中，成纖維細胞（Fibroblast，F(xiàn)b）的激活及轉化為肌成纖維細胞（Myofibroblast，MFb）是肺間質內基質

2、成分過度沉積的關鍵因素。已經證實，肺內MFb有四種來源：間質內的Fb在炎細胞分泌細胞因子作用下轉化成MFb；骨髓干細胞轉化為MFb；肺泡上皮細胞間充質轉分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）；血管內皮細胞間充質轉分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndoMT）。其中EndoMT在肺纖維化形成中的地位和作用已經引起廣泛關注。
　　既往的研究中發(fā)現(xiàn)，PF

3、患者及實驗動物模型肺組織血管密度分布不均，在纖維化區(qū)周邊存在異常的新生血管，而中心區(qū)血管退化[1]。增生的PMVECs分化不全，形成的微血管血液灌注不良，不能發(fā)揮正常的生理功能。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，博萊霉素（Bleomycin，BLM）致PF大鼠PMVECs增殖活躍并分泌促纖維化的細胞因子，如轉化生長因子-β1（Transforminggrowthfactor，TGF-β1）和結締組織生長因子（Connectivetissuegrowth

4、factor，CTGF），而且與PMVECs共培養(yǎng)的Fbs可顯著增加平滑肌肌動蛋白（αsmoothmuscleactin，a-SMA）的表達[2]。目前，PMVECs的這種異常增殖、分泌致纖維化因子及EndoMT的調控因素不明。
　　Notch信號通路廣泛參與機體發(fā)育、細胞分化及穩(wěn)態(tài)調節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，Notch對EC的增殖和分化具有重要的調節(jié)作用。Notch激活可通過抑制血管內皮生長因子受體2（Vascularendothelia

5、lgrowthfactorreceptor2，VEGFR2/Flk-1/KDR）的表達特異性調控由VEGF誘導的EC增殖與分化，使血管正常發(fā)育并維護其生理功能。
　　綜上所述，MFb是肺纖維化形成的標志性細胞，而MFb的來源，包括PMVECs來源的EndoMT，具有多樣化的特點?；贜otch信號在調控增殖的微血管中的作用，我們假設BLM可能降低或損傷了多種細胞的Notch信號通路，致使其成為調控增殖狀態(tài)的PMVECs及Fbs轉化

6、為EndoMT及MFb的前提和基礎。
　　方法和目的
　　本實驗采用氣管內注入BLM誘導SD大鼠PF模型，氣管內注入等體積生理鹽水作為對照。分別于給藥后第7天和第14天處死大鼠，取外周肺組織原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs并鑒定，余肺組織常規(guī)固定、包埋、切片、VG染色。采用免疫組織化學法檢測肺組織中Hes1、KDR的表達；細胞免疫熒光化學法檢測PMVECs中PCNA的表達水平；蛋白印記（westernblot）、實時定量PCR（

7、Real-timePCR）檢測各組PMVECs中Notch信號通路重要分子Hes1、Notch1、Jag1、Dll4的蛋白及mRNA水平的表達；WesternBlot檢測Fbs中Notch信號相關分子的蛋白表達水平；結合各組PCNA和α-SMA的表達情況，以明確PF時Notch信號通路發(fā)生的變化，以及對PMVECs和Fbs增殖、分化的影響。
　　結果
　　1.細胞免疫熒光及WesternBlot檢測BLM組PMVECs的PC

8、NA蛋白表達上調且α-SMA表達增加，免疫組織熒光顯示BLM組肺內有共表達α-SMA和VWF的細胞存在，證實BLM大鼠PMVECs不僅處于增殖狀態(tài)，而且表型已發(fā)生轉變。
　　2.免疫組織化學、WesternBlot、Real-timePCR檢測顯示BLM組PMVECs的Hes1表達下調，KDR表達上調，Jag1表達明顯上調，而Dll4表達較正常組低，提示肺纖維化時PMVECs的Notch信號通路抑制且配體表達異常。
　　3.

9、WesternBlot檢測顯示BLM組Fbs的Hes1表達下調，Jag1上調，同時PCNA及α-SMA的表達水平增高，提示肺纖維化時Notch信號的抑制可能與MFb的產生有關。
　　結論
　　1.PMVECs的EndoMT及Fbs向MFb轉分化可能是BLM大鼠肺纖維化形成的重要原因之一，而Notch信號通路抑制是BLM大鼠異常增殖的PMVECs及Fbs轉分化為EndoMT及MFb的基礎。
　　2.Notch配體Jag1