黃芩苷對TNF-α誘導的血管內皮細胞損傷的影響.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是危害人類健康的主要疾病之一，對．AS發(fā)病機制的研究一直是熱點。雖然人們先后提出脂質浸潤學說、中膜平滑肌增殖學說、血栓源學說等，但都不能對AS的發(fā)病機制提供滿意的解釋。1999年Ross等提出“AS是一種炎癥性疾病”的概念，指出AS是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發(fā)展過程始終伴隨炎癥反應。近年來許多研究認為AS與感染肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，Cpn)

2、有關，本課題組曾報道肺炎衣原體感染血管內皮細胞(vascularendothelial cell，VEC)后，細胞上清中TNF-α含量增加，黃芩苷高、中、低劑量均可使之下調。本研究在前期研究基礎上，繼續(xù)觀察了黃芩苷對TNF-α誘導的血管內皮細胞損傷的影響，以進一步探討黃芩苷的抗損傷機制。 方法： 1．人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞的培養(yǎng)將HUVEC在25cm<'2>的培養(yǎng)瓶內，以含體積分數為15％的小牛血清，100U

3、/ml青、鏈霉素雙抗液的RPIM-1640培養(yǎng)液，在37℃，體積分數為5％CO<,2>培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，當長至80％融合時，用含胰蛋白酶-EDTA消化，傳代。 2．TNF-α及黃芩苷聯合對HUVEC增殖的影響取對數生長期的HUVEC以2.5x10<'5>/ml濃度接種于96孔板，每孔100μl，待長成單層后，加入HNF-α50ng/ml為模型組，加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預處理24h后，再加入TNF-

4、α為黃芩苷高、中、低劑量組，并設立不加任何刺激物者為正常組，正常細胞加黃芩苷組，每組設8個復孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h；結束前4h每孔加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)20μl，4h后每孔再加150μl二甲基亞砜(DMSO)，待沉淀完全溶解后，酶標儀在波長570nm處測OD值。 3．流式細胞儀檢測HUVEC表面CD54、CD106的表達將培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長成單

5、層后，加入TNF-α50ng/ml為模型組；加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預處理24h后，再加入TNF-α50ng/ml為黃芩苷高、中、低劑量組;并設立不加任何刺激物者為正常組；正常細胞加黃芩苷組，每組設4個復孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。 上述24孔板內的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD54、CD106RPE，每管均設立同型對照，暗箱孵育25min后，

6、流式細胞儀檢測。結果CD54以平均熒光強度，CD106以熒光百分比表示。 4．脂多糖(LPS)和佛波酯(PMA)對HUVEC表達CD106的影響將培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長成單層后，分別加入5個不同濃度的LPS、PMA，依次為80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml：并設立不加任何刺激物者為正常組，每組設4個復孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內

7、培養(yǎng)24h。 上述24孔板內的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD106RPE，每管均設立同型對照，暗箱孵育25min后，流式細胞儀檢測。結果CD106以熒光百分比表示。 5．TNF-α對HUVEC凋亡的誘導作用培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長成單層后，加入5個不同濃度的TNF-α，依次為400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng

8、/ml，并設立不加任何刺激物者為正常組，分別培養(yǎng)24h。 上述24孔板內的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按Annexin/PI試劑盒的說明書處理細胞后，流式細胞儀檢測凋亡率，結果以凋亡百分率表示。 6．流式細胞儀檢測細胞凋亡率培養(yǎng)后的HUVEC以1x10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長成單層后，加入TNF-α100ng/ml為模型組；加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預處理24

9、h后，再加入TNF-α為黃芩苷高、中、低劑量組；并設立不加任何刺激物者為正常組；正常細胞加黃芩苷組，每組設4個復孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。 上述24孔板內的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按．AnnexinV/PI試劑盒的說明書處理細胞后，流式細胞儀檢測凋亡率，結果以凋亡百分率表示。 7．統(tǒng)計方法 采用SPSS11.0軟件包的方差分析(ANOVA)模塊進行數據分析，多組間兩兩

10、比較采用LSD法。 抑制率=(1-實驗組/對照組)×100％ 結果： 1．在倒置顯微鏡下觀察HUVEC為貼壁細胞，呈三角形、多角形、梭形或多邊形，“鋪路石”樣緊密鑲嵌排列。感染TNF-α24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)未見明顯改變。 2．TNF-α刺激24h的HUVEC細胞增殖，與正常組比較有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學差異；單獨黃芩苷(120μg/ml)對正常細胞的增殖無影響；黃芩苷高劑量對HUVEC的增殖

11、有促進作用，促增殖率為16％，且P<0.05。 3．TNF-α刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD54的平均熒光強度增加約1.6倍，單獨黃芩苷(120μg/ml)組對正常細胞的CD54無影響；黃芩苷高劑量、中劑量組可有效降低TNF-α誘導的CD54的表達，抑制率分別為41％、15％。TNF-α對HUVEC表面黏附因子CD106的表達無明顯影響。 4．LPS、PMA刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD106的熒光百分比

12、，與正常組比較無差別。 5．TNF-α可誘導HUVEC凋亡，在濃度為100 ng/ml，作用時間24h時，凋亡率最高，為正常組的約2.4倍。 6．黃芩苷高劑量組可抑制TNF-α誘導的凋亡率的增加，抑制率為38％。 結論： TNF-α刺激HUVEC后，細胞表面黏附因子CD54增加，細胞凋亡率亦明顯增加，但對CD106的表達無明顯影響。說明TNF-α對內皮細胞的損傷作用一方面是誘導細胞膜表面黏附因子(CD54

13、)的表達增加，另一方面可能與直接誘導細胞凋亡有關。LPS和PMA對CD106的表達也無明顯影響。 中藥黃芩苷對TNF-α誘導的黏附因子表達有一定的抑制作用，同時對TNF-α誘導的凋亡率增加也有降低效果，體現了黃芩苷在抗炎、抗凋亡方面的作用。 本研究從黏附因子、細胞凋亡兩個方面，采用流式細胞術、MTT法，探討了TNF-α對血管內皮細胞的損傷作用，為AS的慢性炎癥學說提供了細胞學實驗依據。 黃芩苷降低TNF-α誘導的