GDNF及其受體RET在肛門直腸畸形胎鼠直腸末端的表達及意義.pdf

1、目的:觀察膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)及其受體RET在先天性肛門直腸畸形(ARM)胎鼠胚胎發(fā)育過程中直腸末端的表達和分布情況,探討其對 ARM胚胎期腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,為ARM患兒術后排便功能障礙的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:選用健康未經(jīng)產(chǎn)成年SD孕鼠40只,生理鹽水對照組10只和乙烯硫脲組30只,在孕10天時乙烯硫脲組給予10g/L乙烯硫脲(ETU)(125mg/kg)灌胃制作ARM動物模型,對照組則在孕10d灌胃注

2、入等量生理鹽水。兩組孕鼠分別在孕16、18、20天剖腹取出宮內所有胎鼠,肉眼及顯微鏡下觀察兩組肛門發(fā)育情況,并分三組,生理鹽水對照組、乙烯硫脲對照組(未產(chǎn)生ARM胎鼠)、乙烯硫脲畸形組(產(chǎn)生ARM胎鼠)。取胎鼠直腸末端行蘇木素/伊紅(HE)染色,計算三組胎鼠在16、18、20天直腸末端肌間和黏膜下神經(jīng)叢數(shù)量;通過免疫組織化學(IHC)、蛋白印跡(western blot)法檢測三組胎鼠在不同時間點直腸末端GDNF及RET蛋白定位及定量表

3、達情況,實時熒光定量聚合酶連反應(qRT-PCR)法檢測三組胎鼠直腸末端GDNF mRNA的表達情況。
　　結果:
　?、偃庋奂敖馄曙@微鏡大體觀:對照組孕鼠共產(chǎn)胎鼠126只,存活率100％,無肛門直腸畸形發(fā)生,無死胎、發(fā)育不良胎、宮內吸收胎等任何畸形,乙烯硫脲孕鼠組共產(chǎn)胎鼠208只,發(fā)生ARM胎鼠123只,發(fā)生率59.135%,除無肛畸形外,還合并無尾、短尾、四肢畸形、脊柱裂、腦脊膜或骶脊膜膨出、腹裂、臍膨出等畸形。

4、　?、谌M胎鼠肛門組織形態(tài)學改變及直腸末端神經(jīng)叢數(shù)量比較:生理鹽水對照組胎鼠及ETU對照組胎鼠肛門開口位置正常,而ETU畸形組胎鼠肛門開口處為一閉合盲端,無正常肛門解剖結構,直腸末端閉鎖處為增生鱗狀上皮組織及增厚的肌層。生理鹽水對照組和ETU對照組胎鼠在16、18、20天直腸末端神經(jīng)叢數(shù)量,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),三組胎鼠在第16天比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在18天時,生理鹽水對照組、ETU對照組與 ETU

5、畸形組比較差異有統(tǒng)計學意義(11.400±3.134比7.800±1.989,P<0.05;11.200±3.425比7.800±1.989,P<0.05),在第20天時三組比較差異更為顯著(66.100±4.954比25.200±3.048, P<0.01;67.600±5.481比25.200±3.048,P<0.01),生理鹽水對照組、ETU對照組16天、18天與20天比較有顯著性差異(P<0.01),18天的ETU畸形組與16天

6、比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與20天比較有顯著性差異(P<0.01)。
　?、跥DNF、RET蛋白分布及表達情況:GDNF、RET主要表達在胎鼠直腸末端肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢的胞膜及胞質中,在第16天三組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在18和20天生理鹽水對照組、ETU對照組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),GDNF、RET在18天生理鹽水對照組、ETU對照組與ETU畸形組比較有統(tǒng)計學意義(41.62

7、5±3.888比23.281±3.993, P<0.01;41.349±1.799比23.281±3.993,P<0.01;42.000±12.275比27.643±6.540,P<0.05;41.965±10.374比27.643±6.540,P<0.05),GDNF、RET在20天生理鹽水對照組、ETU對照組與ETU畸形組比較有顯著性差異(165.209±12.35比48.738±8.262, P<0.01;162.153±13.0

8、20比48.738±8.262,P<0.01;122.107±17.250比40.807±9.933,P<0.01;125.529±18.754比40.807±9.933,P<0.01),GDNF、RET在生理鹽水對照組和 ETU對照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而和20天比較有顯著性差異(P<0.01),GDNF、RET在 ETU畸形組18天與16、20天比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而16天和20天比

9、較有顯著性差異(P<0.01)。
　?、蹽DNF、RET蛋白定量情況:在16天三組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在18、20天生理鹽水對照組和ETU對照組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), GDNF、RET在18天生理鹽水對照組、ETU對照組與ETU畸形組比較差異有統(tǒng)計學意義(0.706±0.076比0.478±0.027,P<0.01;0.686±0.068比0.478±0.027,P<0.01;0.292±0.

10、063比0.105±0.047,P<0.05;0.293±0.093比0.105±0.047,P<0.05),GDNF、RET在20天生理鹽水對照組、ETU對照組與 ETU畸形組比較有顯著性差異(1.655±0.063比0.501±0.030, P<0.01;1.589±0.072比0.501±0.030, P<0.01;1.333±0.134比0.208±0.148,P<0.01;1.395±0.194比0.208±0.148,P<0

11、.01),GDNF、RET在生理鹽水對照組和ETU對照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而和20天比較有顯著性差異(P<0.01),而ETU畸形組GDNF、RET差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　⑤GDNF mRNA表達情況:在16天三組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在18、20天生理鹽水對照組和ETU對照組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),GDNF mRNA在18天生理鹽水對照組、ETU

12、對照組與ETU畸形組比較差異有統(tǒng)計學意義(103.624±27.533比79.169±11.697, P<0.05;105.184±19.634比79.169±11.697, P<0.05),GDNF mRNA在20天生理鹽水對照組、ETU對照組與ETU畸形組比較有顯著性差異(151.496±33.622比94.873±11.309, P<0.01;150.738±21.423比94.873±11.309,P<0.01),在生理鹽水對照

13、組和ETU對照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與20天比較有顯著性差異(P<0.01),GDNF mRNA在ETU畸形組18天與16、20天比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而16天和20天比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　結論:
　?、貵DNF及受體 RET在正常胚胎直腸腸壁肌間及粘膜下的分布及表達是隨著胚胎的不斷發(fā)育逐漸增強;而在ARM胎鼠的直腸腸壁肌間及粘膜下的分布及表達是明顯減弱,并隨著