截肢后大鼠肝腎損傷及其防護機制的研究.pdf

1、背景與目的：當機體受到創(chuàng)(燒)傷、手術(shù)、休克等打擊時，會產(chǎn)生一系列防御反應，由于創(chuàng)傷本身及機體的過度性防御可能造成全身性的損傷，以心、腦、腎、肝等重要遠隔臟器的損傷較重。腎臟為人體重要的排泄毒素、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡及內(nèi)分泌器官，肝臟為人體重要的合成和代謝器官，在應激條件下，均易受到損傷。臨床上一旦出現(xiàn)急性腎功能衰竭，死亡率極高，但因其病理生理機制至今未明，早期診斷并采取有效的預防措施較為困難，而急性肝損害在嚴重創(chuàng)傷后也可出現(xiàn)，其機制也不明

2、確。目前人們已逐漸認識到創(chuàng)傷是一種系統(tǒng)性疾病，從心臟手術(shù)、嚴重燒傷等動物模型和臨床實驗中，研究創(chuàng)傷后的遠隔臟器的損傷；從血流動力學的改變、炎癥反應、過氧化作用等方面研究其發(fā)生機制。本實驗旨在建立截肢創(chuàng)傷模型來研究肝腎早期損傷的發(fā)生機制和防治措施，因而建立了截肢創(chuàng)傷后大鼠腎臟、肝臟的損傷模型，觀察截肢后炎癥、免疫、氧化因子等因素及病理學變化，并引入新型生物學指標：腎損傷分子-1檢驗其在該模型中對于急性腎損傷的預警作用。同時設立硫化氫(H2

3、S)供體硫氫化鈉(NaHS)、胱硫醚Y-裂解酶(CSE)抑制劑炔丙基甘氨酸(PPG)、免疫抑制劑他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K-506)、醛固酮(ALD)抑制劑螺內(nèi)酯干預組，進一步研究以上途徑在截肢后肝腎損傷中的作用及其機制，以期為早期發(fā)現(xiàn)、診斷及有效干預創(chuàng)傷后肝腎損傷提供新方法和新措施。本實驗分為兩大部分：一、研究截肢后急性肝腎損傷發(fā)生的病理生理機制、早期預警指標及NaHS、PPG、FK506、螺內(nèi)酯干預在急性肝腎損傷過程中的作

4、用及其作用機制；二、研究創(chuàng)傷后肝腎線粒體的功能變化及NaHS、PPG、FK506、螺內(nèi)酯的干預效果。
　　 方法：本實驗應用大鼠左后肢截肢模型。第一部分實驗分組：雄性Wistar大鼠91只，隨機分為13組。正常對照組、手術(shù)后1h組、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h組及NaHS、PPG、FK-506、螺內(nèi)酯干預組。干預組大鼠均在術(shù)后6小時處死(處死時間點由預實驗結(jié)論得來)。每組7只。
　　 觀察各組大鼠肝腎

5、組織病理改變及血漿硫化氫(H2S)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、血管緊張素II(AngII)、醛固酮(ALD)、一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、腎損傷分子-1(KIM-1)及肌酐(Cr)、尿素(Ur)水平的變化，同時檢測各組大鼠腎組織腎損傷分子-1(KIM-1)、肝腎組織胱硫醚γ-裂解酶(CSE)活性、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、醛固酮(ALD)的含量及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CnA-α)基因的表達。

6、>　　 第二部分實驗分組：雄性SD大鼠48只，分為：正常對照組、截肢后6h組、干預組(分為4組：分別給予NaHS、PPG、FK-506、螺內(nèi)酯干預，截肢后6h處死)，每組8只。檢測肝腎組織線粒體呼吸控制率(RCR)、膜電位、ATP酶活性的變化。
　　 結(jié)果：與正常對照組比較，截肢術(shù)后肝腎臟器出現(xiàn)不同程度組織充血水腫、細胞腫脹，截肢術(shù)后6h損傷最重，同時伴有血漿Cr、ALT、AST的下降。血漿及腎組織KIM-1在正常組合量極低，

7、截肢后1小時呈持續(xù)升高，并明顯早于血Cr的升高。截肢后大鼠血漿MPO、MDA、IL-6、AngII濃度呈現(xiàn)升高趨勢，血漿H2S、NO濃度在截肢后下降。肝腎組織中MPO、MDA含量在截肢后出現(xiàn)升高與血漿基本相似，而CSE活性下降近似于血漿H2S濃度變化。血漿及腎組織ALD水平呈現(xiàn)雙峰樣改變，在截肢后1h即升高，隨后降低，截肢后6h達最低值，然后開始升高。CAn-α基因的表達在截肢后肝腎組織中均呈現(xiàn)升高趨勢。
　　 與截肢后6h比較

8、，NaHS干預后血漿Cr、NO、ALD、AngII、MPO、H2S顯著升高，血漿Ur、ALT，AST無明顯變化，血漿MDA、KIM-1、IL-6顯著降低。腎組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO、KIM-1水平也顯著降低，而CSE活性、ALD含量、CaN基因的表達顯著升高。肝組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO水平也顯著降低，而CSE活性、CaN基因的表達顯著升高。
　　 PPG干預后各項指標的變化：血漿ALT、AST、NO、AL

9、D、AngII、MPO、H2S、IL-6水平顯著降低，而血漿Ur、MDA無明顯變化。血漿Cr、KIM-1顯著升高。腎組織病理性損傷略有加重，且MPO無顯著變化，MDA含量、CaN基因的表達、KIM-1也顯著升高，而CSE活性、ALD濃度顯著降低。肝組織病理性損傷無明顯加重，MDA、MPO水平無顯著變化，CaN基因的表達顯著升高，而CSE活性、顯著降低。
　　 螺內(nèi)酯干預后各項指標的變化：血漿ALD、AngII、MDA、MPO、I

10、L-6顯著降低，而血漿Cr、Ur、MDA無明顯變化，血漿ALT、AST、NO、H2S、KIM-1顯著升高。腎組織損傷有所減輕，但MDA無顯著變化，CSE活性、ALD、KIM-1含量顯著升高，而MPO、CaN基因的表達顯著降低。肝組織充血、水腫及細胞損傷減輕，但CSE活性無顯著變化，而MPO、MDA、CaN基因的表達顯著降低。
　　 FK506干預后各組指標變化：血漿Cr、MDA、MPO、KIM-1、IL-6顯著下降，而血漿Ur無

11、明顯變化，血漿ALT、AST、NO、ALD、AngII、H2S顯著升高。腎組織病理性損傷減輕，且MDA、MPO、KIM-1水平及CaN基因的表達也顯著降低，而CSE活性、ALD濃度顯著升高。肝組織病理性損傷也有減輕，且MDA、MPO水平及CaN基因的表達也顯著降低，CSE活性顯著升高。
　　 截肢后大鼠肝腎組織線粒體呼吸控制率、膜電位、ATP酶活性均明顯下降，給予NaHS、FK-506、螺內(nèi)酯干預后有不同程度回升，PPG干預后以

12、上指標出現(xiàn)不同程度升高或無明顯變化。
　　 結(jié)論：截肢術(shù)可造成大鼠的急性肝腎損傷。腎損傷分子-1為較敏感、可靠的判斷截肢術(shù)后急性腎損傷的生物學指標，可起到早期預警的作用。H2S/CSE體系參與了截肢術(shù)后肝腎臟器的損傷過程，NaHS可對損傷的肝腎組織起保護作用，PPG的應用可能進一步加重組織損傷。CaN與截肢后肝腎的損傷過程密切相關，使用FK506干預可對截肢后損傷的腎組織具有保護作用。ALD參與截肢創(chuàng)傷后肝腎急性損傷過程，螺內(nèi)酯