氯通道ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、研究背景：
　　在人的一生中骨總是在不斷的改建與重塑，正畸治療正是利用骨吸收與骨改建的原理治療錯(cuò)牙合畸形的一門(mén)學(xué)科，因此對(duì)于骨形成與骨改建機(jī)理的揭示對(duì)于正畸治療理論基礎(chǔ)研究是至關(guān)重要的。成骨細(xì)胞是參與骨形成及骨改建過(guò)程的重要細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖、分化及調(diào)控是骨形成機(jī)理研究的重要內(nèi)容。研究表明許多因素參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的成骨分化，已發(fā)現(xiàn)有許多離子通道與細(xì)胞的成骨分化有關(guān)，如Ca2+、K+等，作為體內(nèi)最主要的陰離子通道——氯通道在成骨分化中

2、的作用還知之甚少。
　　近年來(lái)，隨著對(duì)氯通道結(jié)構(gòu)的深入認(rèn)識(shí)，和一些與氯通道基因突變相關(guān)的人類遺傳性疾病的發(fā)現(xiàn)與研究，氯通道在生物體內(nèi)的重要作用越來(lái)越引起了人們的關(guān)注。ClC型氯通道是一大類電壓門(mén)控型的氯通道，構(gòu)成了一個(gè)大的基因家族。其中，ClC-3、ClC-4和ClC-5為內(nèi)體系統(tǒng)的ClC型氯通道，由于其基因序列的高度相似性組成了ClC型氯通道家族的一個(gè)分支，主要參與神經(jīng)細(xì)胞突觸囊泡和細(xì)胞內(nèi)體的酸化作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)體系統(tǒng)的

3、ClC型氯通道基因敲除的小鼠表現(xiàn)出生長(zhǎng)阻滯及骨發(fā)育的異常，提示我們ClC-3、ClC-4和ClC-5可能與細(xì)胞的成骨分化有關(guān)。
　　研究目的：
　　本研究目的在于觀察ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化，從而進(jìn)一步探求ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細(xì)胞分化中的作用，并初步研究分析其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　體外分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)小鼠

4、顱頂骨來(lái)源的成骨細(xì)胞及小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1，利用RT-PCR方法檢測(cè)ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在以上三種成骨譜系細(xì)胞中的表達(dá)。利用成骨條件培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，用RT-PCR及real-timePCR方法檢測(cè)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過(guò)程中ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的表達(dá)變化。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因全長(zhǎng)的質(zhì)粒，構(gòu)建瞬時(shí)過(guò)表達(dá)ClC-3、Cl

5、C-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細(xì)胞體系。同樣，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的干擾siRNA，構(gòu)建干擾ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達(dá)的MC3T3-E1細(xì)胞體系。用RT-PCR及real-timePCR方法檢測(cè)兩種基因表達(dá)體系中，成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。在基因過(guò)表達(dá)體系中，檢測(cè)細(xì)胞體外礦化能力的變化，并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的酸堿變化。用細(xì)胞免疫熒光方法，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)MC3

6、T3-E1細(xì)胞中的氯通道及TGF-β1進(jìn)行定位。分析前期研究結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)氯通道在成骨分化中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　研究結(jié)果：
　　RT-PCR結(jié)果顯示，在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細(xì)胞以及小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞中均有ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的陽(yáng)性表達(dá)。在MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)中，伴隨成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達(dá)增強(qiáng)，ClC-3、ClC-4

7、和ClC-5氯通道基因的表達(dá)也顯著增強(qiáng)。在過(guò)表達(dá)ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細(xì)胞中，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)內(nèi)體系統(tǒng)的酸化作用加強(qiáng)，細(xì)胞體外的礦化能力明顯加強(qiáng)。在干擾了ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達(dá)的MC3T3-E1細(xì)胞中，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達(dá)顯著降低。在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ClC-3氯通道定位于細(xì)胞內(nèi)核周圍內(nèi)體和

8、溶酶體等細(xì)胞器。ClC-3與TGF-β1的表達(dá)有共定位，且過(guò)表達(dá)ClC-3基因能明顯下調(diào)TGF-β1的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)ClC-3基因的MC3T3-E1細(xì)胞中，干擾Runx2的基因表達(dá)后，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2、Osx的表達(dá)被明顯抑制。
　　結(jié)論：
　　ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道存在于小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細(xì)胞以及小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1等成骨譜系細(xì)胞中。ClC-