脫細胞牛心包上種植混合細胞構建組織工程心臟瓣膜的實驗研究.pdf

1、第一部分牛心包組織工程心臟瓣膜支架的制備 目的:心血管組織工程為構建理想的心臟瓣膜替代物提供了新思路，支架材料是構建組織工程心臟瓣膜(tissue—engineered heart valves．TEHVs)的基礎。本實驗對比去污劑～酶消化法(detergent and enzvme extraction，DEE)、胰蛋白酶消化法(trypsin，TS)和去氧膽酸鈉法(Triton—X100 and sodium—deoxych

2、olate，TSD)去除新鮮牛心包組織上細胞的效果和保護基質的能力，為TEHVs構建提供較滿意的支架材料。 方法:應用三種方法處理新鮮牛心包組織，用光學顯微鏡、掃描電鏡觀察脫細胞效果和膠原纖維、彈力纖維改變；熱皺縮實驗、拉力測試觀察基質的物理性能變化；DNA抽提比較脫細胞前后細胞數(shù)量差異。 結果:形態(tài)學觀察顯示：三種方法均能完全去除細胞，但是與去污劑一酶消化法比較，其它兩種方法對基質破壞明顯。DEE、TS、TSD和對照

3、組(n=10)熱皺縮溫度分別為64.50℃±2.13℃、64.12℃±2.42℃、65.36℃±1.70℃、66.26℃±2.01℃，P>0.05，無統(tǒng)計學意義。DEE組與對照組在彈性模量、拉伸強度、最大變形量、最大載荷、拉伸率五項指標的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TS、TSD兩組與對照組在五項指標的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DNA抽提DEE組0.054gg/mg±0.007μg/g；TS組0.56gg/mg±0.0

4、10μg/mg；TSD組0.051μg/mg±0.012μg/mg；對照組0.602μg/mg±0.102μg/mg。DEE、TS、TSD組分別與對照組比較，均有顯著性差異。 結論:去污劑一酶消化法脫細胞效果好，且有良好的保護基質能力。 第二部分心瓣膜組織工程中種子細胞原代聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究 目的:探討體外原代聯(lián)合培養(yǎng)、擴增，鑒定同一來源人血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞的方法，為TEHVs構建提供理想的種子

5、細胞。 方法:無菌條件下取冠狀動脈旁路移植術中大隱靜脈3cm～8cm，組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)混合血管細胞，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)、擴增內皮細胞。倒置顯微鏡、免疫組化方法對內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞進行鑒定。 結果:倒置顯微鏡結果顯示：原代細胞及經傳代培養(yǎng)后的細胞，呈現(xiàn)內皮樣細胞、成纖維樣細胞混合生長的特征。免疫細胞化學檢測示內皮細胞VIII因子、平滑肌細胞α-肌動蛋白、成纖維細胞FibrOnectin相關抗原呈陽性反應。

6、細胞經3～4次傳代，細胞數(shù)量可增殖達到8～10×10<'6>。 結論:組織塊法原代培養(yǎng)可獲得內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞，三種細胞經體外聯(lián)合培養(yǎng)、傳代，數(shù)量可達到TEHVs種子細胞要求。第三部分去細胞牛心包上動態(tài)混合種植血管混合細胞構建組織工程心臟瓣膜目的:探討在去細胞牛心包上種植血管混合細胞構建組TEHVs的方法與效果。 方法:將體外原代培養(yǎng)的人大隱靜脈血管混合細胞動態(tài)種植在脫細胞牛心包支架材料上，構建TEHVs，

7、動態(tài)觀察種子細胞形態(tài)學、免疫組織化學變化和脫細胞牛心包表面超微結構變化；收集瓣膜構建各期培養(yǎng)液，應用發(fā)色底物法測定內皮細胞分泌的t-PA和PAI-1的活性。 結果:種子細胞逐漸全層覆蓋脫細胞牛心包表面，而后分成數(shù)層并浸潤至支架材料內部生長；免疫組化顯示：內皮細胞VⅢ因子、平滑肌細胞α-肌動蛋白、成纖維細胞Fibronectin相關抗原呈陽性表達；種子細胞能分泌纖溶活性物質t-PA和PAI-1；種植種子細胞后脫細胞牛心包表面為扁平

8、、片狀、大小欠規(guī)則的細胞覆蓋，細胞漸重疊、分層，細胞表面有少量絨毛和纖細的纖維結構。 結論:混合細胞種植后附著滿意，與脫細胞牛心包生物相容性滿意，生長狀況好，具有內皮功能。 目的:將血管混合細胞體外動態(tài)種植于脫細胞牛心包構建的TEHVs移植入裸鼠體內，觀察其生物學特征變化。 方法:將體外動態(tài)構建的TEHVs移植入裸鼠體內，15d、30d時處死，觀察組織、細胞的超微結構變化，種子細胞的生長行為和生物學特征變化，種子

9、細胞與支架材料的黏附性，TEHVs的生物相容性等技術參數(shù)。 結果:組織學觀察見：細胞數(shù)量、分層數(shù)較移植前增多，并有大量細胞浸潤入TEHVs深層組織內；免疫組化顯示：TEHVs上細胞的內皮細胞VⅢ因子、平滑肌細胞α-肌動蛋白、成纖維細胞Fibronectin相關抗原呈陽性表達；掃描電鏡見：裸鼠體內移植后細胞數(shù)量較移植前增多，細胞表面和細胞之間的網狀膠原結構較埋置前增多明顯；透射電鏡可見：W-P小體、質膜小泡、密斑、密體、微絲等特征