利用CDK抑制劑-SU9516體外生產(chǎn)豬孤雌激活四倍體囊胚.pdf

1、現(xiàn)如今，四倍體廣泛的應用在動物繁殖技術(shù)領域中，特別是在干細胞中利用四倍體和二倍體制備嵌合體來研究動物胚外組織缺陷。通過不同的技術(shù)有多種四倍體囊胚的制作方法，但是不同制備方法都存在不同程度的優(yōu)缺點，需要不斷開發(fā)新的四倍體制備方法。因此，本研究使用一種新型細胞周期性依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑SU9516體外高效誘導豬孤雌激活(parthenogenetic activation，PA)四倍體囊胚

2、。SU9516可以通過抑制豬PA胚胎第二極體的排出以及抑制中心體復制兩方面來體外制備豬PA四倍體囊胚。同時，SU9516可以通過抑制CDK1活性間接降低MPF活性來提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力。本研究主要包括以下幾個實驗:
　　一、SU9516體外制備豬PA四倍體囊胚。
　　試驗1:電激活豬胚胎之后，在豬PA胚胎體外培養(yǎng)液中添加不同濃度SU9516促進豬其體外發(fā)育能力。結(jié)果表明:添加10μMSU9516與其他濃度（1μM，5μ

3、M，100μM）及素對照組5μg/ml細胞松弛(cytochalasin B，CB)相比可以顯著地提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力(47.5％ vs.26.2％，28.9％，40.6％，and25.8％，P＜0.05)。用最佳濃度(10μM)SU9516處理不同的時間后觀察胚胎體外發(fā)育能力，結(jié)果表明:SU9516處理4h豬PA胚胎具有最好的體外發(fā)育能力(47.5％vs.39.0％，33.7％，and39.1％)。
　　試驗2:電激活豬P

4、A胚胎之后，分別利用添加10μM SU9516或5μg/ml CB的體外培養(yǎng)液中處理2h后觀察豬PA胚胎第二極體的排出情況。結(jié)果表明:10μMSU9516組，5μg/ml CB組與未處理組相比顯著地降低了第二極體的排出率(14.0％，13.8％ vs.78.8％P＜0.05)。為了確定囊胚的染色體組數(shù)，對SU9516組合、CB組處理后獲得的豬PA囊胚進行核型分析。結(jié)果顯示:SU9516處理組的囊胚中四倍體率顯著地高于CB處理組(55.8

5、％ vs.14.0 P＜0.05)
　　試驗3:為了進一步確認不同處理組中豬PA囊胚的染色體組數(shù)。利用Hoechest33342染色不同處理組中的細胞數(shù)目。結(jié)果表明:SU9516處理組中囊胚細胞數(shù)顯著地低于CB組以及6-DMAP組(34.4±17.58 vs.46.4±10.5a，45.1±10.6a)。
　　二、SU9516抑制MPF活性提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力。
　　實驗1:分別檢測10μM SU9516和5μg

6、/ml CB處理豬PA胚胎4h后MPF表達活性。結(jié)果顯示:SU9516處理下的豬PA胚胎MPF活性水平顯著地低于CB組(103.2pg/ml vs.131 pg/ml)。
　　總結(jié):1、1）SU9516處理提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力最佳條件為10μM，4h。
　　2)SU9516可以抑制豬PA胚胎第二極體排出和誘導豬PA四倍體囊胚。
　　3)SU9516處理可以顯著地降低豬PA囊胚細胞數(shù)。
　　2、SU9516通