卵母細胞分泌因子在人MⅡ卵母細胞的卵丘顆粒細胞中的表達及其與卵母細胞發(fā)育潛能關系的研究.pdf

1、目的:卵丘顆粒細胞(Cumulus Cells，CCs)為直接包繞在卵母細胞周圍的顆粒細胞，分解代謝膽固醇和葡萄糖等物質，通過與卵母細胞周圍的縫隙連接為卵母細胞提供能量，在卵母細胞發(fā)育成熟、排卵至受精的整個過程中起著關鍵性的作用。近年來的研究提示CCs中基因表達的差異可以作為預測卵子及胚胎發(fā)育潛能的一種有效的非侵入性方法。GDF-9、BMP-15、TGFβ1均為TGF-β超家族成員，Smads是TGFβ超家族下游信號傳導分子，但是Sma

2、d3在CCs中的作用還不確定。GDF-9可以啟動始基卵泡，促進卵泡生長，刺激CCs增殖，刺激卵丘膨脹，促進透明質酸酶合成，調控卵母細胞減數分裂能力，提高卵母細胞發(fā)育潛能。BMP-15具有促進CCs減數分裂與增殖的作用，并且其促進CCs減數分裂的作用是不依賴于FSH的。TGFβ1通過對CCs上受體的作用而影響卵母細胞的發(fā)育和其后的受精分裂潛能，TGFβ1對卵子的質量及早期胚胎發(fā)育起著關鍵作用。TGFβ/Smads能促進CCs的增殖與分化，

3、和促性腺激素共同調控卵泡的生長。GDF-9可以刺激人卵巢CCs中Smads蛋白的磷酸化水平升高，與Ⅰ型受體及Ⅱ型結合后激活Smad3，能促進CCs增殖。
　　本實驗通過分析單卵母細胞所對應的CCs中GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3的表達水平，探討上述細胞因子與卵母細胞質量與發(fā)育潛能的關系;觀察常規(guī)長方案和微刺激方案2種超促排卵處理方法對細胞因子表達的影響，比較2種超排處理方法對卵母細胞質量及其發(fā)育潛能的差異。

4、r>　　方法:
　　1、研究對象
　　收集2013.10～2014.12期間在石家莊白求恩國際和平醫(yī)院生殖中心接受ICSI助孕治療的患者41例332份CCs，納入標準:年齡＜35歲;雙側卵巢無手術史;基礎激素水平正常（月經周期第2-3天，FSH＜10IU/L，E2＜50pg/ml，PRL在正常范圍）;月經周期正常（26-32天）;體重指數BMI18-25;無其他慢性疾病及內分泌疾病，近3個月內未應用過激素類藥物。排除標準:高

5、雄激素血癥的表現;PCOS;子宮內膜異位癥。不孕原因主要為男方因素或曾有過IVF不受精史。所有受試患者均經醫(yī)院倫理委員會批準后，簽署知情同意書。
　　2、控制性超促排卵用藥方案
　　(1)患者采用常規(guī)長方案促排卵:在黃體中期開始給予GnRH-a皮下注射降調節(jié)，達到降調節(jié)標準后給以促卵泡成熟激素果納芬進行促排卵，啟動劑量一般給予150-300 IU/d皮下注射，根據患者卵泡發(fā)育情況及卵巢基礎竇狀卵泡數目及時調整藥物劑量，當雙側

6、卵巢中直徑≥18mm/≥14mm的卵泡為60％-70％，測血清E2/14mm的卵泡為200～300 pg/ml時停藥，給予重組人絨毛膜促性腺激素250μg(rHCG，Ovidre，Merck SeronoSwitzerland)皮下注射，36h后陰道超聲引導下取卵。
　　(2)患者采用微刺激方案促排卵:在月經第3天給予HMG（注射用尿促性素）常規(guī)劑量225IU/天注射，同時給予藥物來曲唑2.5mg/天口服，5天后停用LE，給予CC

7、（氯米芬）50mg/天口服，當雙側卵巢中直徑≥18mm/≥14mm的卵泡為60％-70％，測血清E2/14mm的卵泡為200～300pg/ml時停藥，給予達菲林0.1mg皮下注射，36h后陰道超聲引導下取卵。
　　3、CCs的留取
　　扳機36h后陰道超聲引導下取卵，找到卵-冠-丘復合物(COC)，將單COC放入MOPS制成的微滴中，用機械法小心剝離卵子周圍的CCs，將微滴中的卵丘顆粒細胞裝入小EP管中，用PH值為7.4的P

8、BS液反復沖洗，凍存于-80℃冰箱實驗備用。
　　4、RNA的提取及逆轉錄(RT)反應
　　RNA的提取方法按照Trizole法進行，加入20μL DEPC水充分溶解。然后將提取的RNA取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，測定結果符合標準后，從各樣品中提取8μL RNA樣品加入到20μL逆轉錄的體系中，按照ReverseTranscription Reaction試劑盒的說明書的操作要求進行逆轉錄反應，反應條件如下:70℃10min

9、，42℃50min，95℃5min。
　　5、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)
　　應用Primer Premier5.0軟件設計目的基因和內參基因(RPL-15)引物序列。各基因引物序列見表1。反應按照QIAGEN Rotor-Gene Q公司QuantiFast(@) SYBR(@) Green PCR kit熒光定量PCR反應試劑盒說明書進行:具體條件設置如下:95℃預變性2 min;95℃變性15s，60℃退

10、火/延伸30s，共40個循環(huán)。運算分析最終所得Ct值。
　　6、數據統(tǒng)計分析
　　將real time RT-PCR所得的Ct值按照公式2△Ct進行運算，數據以均數±標準差（(x)±s）表示，利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，比較組間細胞因子水平的差異采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、CCs根據促排卵方案不同分為兩組:常規(guī)長方案組（CC=172份）及微刺激組（CC=1

11、60份）。因卵母細胞與卵丘顆粒細胞是一一對應的，所以根據每個卵子受精、卵裂及囊胚發(fā)育情況，回顧性將CCs進行分組。根據卵子受精情況將CCs分為正常受精組（長方案組CCs=127份，微刺激方案組CCs=136份）及異常受精組（長方案組CCs=45份，微刺激方案組CCs=24份）;正常受精組根據第3日胚胎卵裂情況分為優(yōu)質卵裂胚形成組（長方案組CCs=58份，微刺激方案組CCs=76份）及非優(yōu)質卵裂胚形成組（長方案組CCs=69份，微刺激方案

12、組CCs=60份）;非優(yōu)質卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng)，根據第5日形成囊胚情況，分為優(yōu)質囊胚形成組（長方案組CCs=24份，微刺激方案組CCs=12份）及非優(yōu)質囊胚形成組（長方案組CCs=45份，微刺激方案組CCs=48份）。未成熟、畸形卵子所對應的卵丘顆粒不列入分組研究中。共有41例患者332份（常規(guī)長方案患者21例172份，微刺激方案20例160份）卵丘顆粒細胞用于RT-PCR檢測。
　　2、人卵丘顆粒細胞中GDF-9與卵母細胞發(fā)育潛能的關

13、系
　　GDF-9有利于卵母細胞受精、卵裂及囊胚的形成。通過本實驗可以看出，2種促排卵方案中，GDF-9 mRNA相對表達量:正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.020，P=0.001);優(yōu)質卵裂胚形成組顯著高于非優(yōu)質卵裂胚形成組(P=0.001，P=0.043);優(yōu)質囊胚形成組與非優(yōu)質囊胚形成組間有統(tǒng)計學差異(P=0.002，P=0.001)。
　　3、人卵丘顆粒細胞中BMP-15與卵母細胞發(fā)育潛能的關系
　　通過

14、本實驗可以看出，不論常規(guī)長方案組還是微刺激方案組，BMP-15mRNA的相對表達量在卵母細胞發(fā)育的不同結局中均有顯著性差異。2種促排方案中，BMP-15mRNA相對表達量:正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.000，P=0.000);優(yōu)質卵裂胚形成組與非優(yōu)質卵裂胚形成組，組間有顯著性差異(P=0.003，P=0.048);優(yōu)質囊胚形成組與非優(yōu)質囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學差異(P=0.033，P=0.029)。可以看出，BMP-15mRN

15、A相對含量與卵母細胞發(fā)育潛能成正相關。
　　4、人卵丘顆粒細胞中TGF-β1與卵母細胞發(fā)育潛能的關系
　　TGFβ1含量與卵子的質量和發(fā)育潛能密切相關。TGF-β1基因mRNA無論在常規(guī)長方案組還是微刺激方案組中，其相對表達量在正常受精組中顯著高于異常受精組(P=0.003，P=0.022);優(yōu)質卵裂胚形成組顯著高于非優(yōu)質卵裂胚形成組(P=0.015，P=0.022);優(yōu)質囊胚形成組與非優(yōu)質囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學差異(P=

16、0.001，P=0.025)。
　　5、人卵丘顆粒細胞中Smad3與卵母細胞發(fā)育潛能的關系
　　常規(guī)長方案組及微刺激方案組中，Smad3 mRNA的相對表達量正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.006，P=0.012):優(yōu)質卵裂胚形成組與非優(yōu)質卵裂胚形成組，組間比較有顯著性差異(P=0.019，P=0.041);優(yōu)質囊胚形成組與非優(yōu)質囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學差異(P=0.000，P=0.028)?？梢钥闯觯亚痤w粒細胞中S

17、mad3 mRNA的含量較高的卵母細胞有較好的發(fā)育潛能。
　　6、不同促排方案與GDF-9、BMP-15、TGF-β1和Smad3表達量的關系
　　常規(guī)長方案與微刺激方案中，年齡無統(tǒng)計學差異。GDF-9和Smad3相對表達量在常規(guī)長方案組中顯著高于微刺激方案組(P=0.000，P=0.004，P=0.005)，BMP-15相對表達量在微刺激組中顯著高于常規(guī)長方案組(P=0.004)，而TGF-β1相對表達量在常規(guī)長方案組中和

18、微刺激方案組中無統(tǒng)計學差異(P=0.653)。提示GDF-9、BMP-15和Smad3因子在CCs中的表達量與促排卵方案有關，常規(guī)長方案組可以刺激CCs分泌更多的GDF-9和Smad3因子，微刺激方案組可以刺激CCs分泌更多的BMP-15因子，TGF-β1相對含量與促排卵方案無關。
　　結論:
　　1、GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3在卵丘顆粒細胞中的相對表達量與卵母細胞質量及發(fā)育潛能成正相關，提示其可以作