p38絲裂原活化蛋白激酶在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦血管痙攣(cerebrovascularvasospasmCVS)是動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhageSAH)后最常見的并發(fā)癥之一，它的高致死率(15～20％)、致殘率(約50％)嚴(yán)重威脅到人類的健康。CVS通常分為兩種：一是SAH后破入蛛網(wǎng)膜下腔中的血液對(duì)腦血管的機(jī)械性刺激作用所致的暫時(shí)性或早發(fā)性CVS。這種早發(fā)性CVS在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中?？梢姷?，但在人類證據(jù)尚不充分；二是出血數(shù)天后發(fā)生、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的遲

2、發(fā)性CVS(delayedcerebrovascularvasospasmDCV)。DCV是臨床上最常見的CVS，一旦發(fā)生，往往難以逆轉(zhuǎn)，對(duì)血管擴(kuò)張劑的反應(yīng)較差，導(dǎo)致進(jìn)一步的缺血性腦損害。CVS的治療缺乏十分有效的方法，原因在于致病機(jī)理迄今尚未明了。目前研究認(rèn)為SAH后血凝塊的一些分解產(chǎn)物，如血紅蛋白(Hb)、內(nèi)皮素(ET)、凝血酶(thrombi)、5-羥色胺(5-HT)等能引起腦血管收縮，但并不能完全解釋CVS的致病機(jī)制。近幾年來研

3、究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signaltransductionpathways)可能會(huì)誘導(dǎo)CVS的發(fā)生。此機(jī)制主要通過三個(gè)途徑誘導(dǎo)平滑肌的收縮運(yùn)動(dòng)：①肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinaseMLCK)途徑②蛋白激酶C(proteinkinaseCPKC)途徑③促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMAPK)途徑。其中MLCK途徑在多個(gè)實(shí)驗(yàn)性研究中被證實(shí)參與

4、了SAH后早發(fā)性CVS的形成，而PKC途徑是否在CVS中起作用存在爭(zhēng)論。MAPK途徑目前處于實(shí)驗(yàn)研究階段，相關(guān)報(bào)道甚少。p38是MAPK家族成員之一，目前明確在各種生命活動(dòng)中發(fā)揮廣泛而重要的作用，包括：①調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生②調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)亡③調(diào)節(jié)基因表達(dá)④誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究針對(duì)p38的生物功效，通過兩個(gè)方面探討p38MAPK在CVS中的作用。 第一部分初步探討p38MAPK在CVS中的作用 研究目的是研究p38MA

5、PK在兔二次注血模型后痙攣的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)與基底動(dòng)脈變化規(guī)律的關(guān)系，初步探討p38MAPK在腦血管痙攣形成機(jī)制中的作用。35只雌性新西蘭白兔，體重2.8～3.0Kg，隨機(jī)分為：對(duì)照組(N=5)，SAH組(N=10)、SAH+DMSO(N=10)、SAH+SB203580組(N=10)。其中SAH組、SAH+DMSO組、SAH+SB203580組每組又分別按照在首次注血后day5、day7活體灌注處死進(jìn)行對(duì)照而分為2個(gè)小組(n

6、=5)。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型，即在day0和day2時(shí)分別經(jīng)枕大池兩次注射自體動(dòng)脈血(0.5ml/Kg)。從day3開始，SAH+DMSO、SAH+SB203580兩組動(dòng)物，枕大池內(nèi)分別注入干預(yù)藥物DMSO、p38MAPK特異性抑制劑SB203580，持續(xù)到各組處死前一天。動(dòng)物處死采用活體經(jīng)左心室灌注10％的緩沖中性甲醛。處死后，立即開顱取含有基底動(dòng)脈全長(zhǎng)的腦干及腦組織，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底動(dòng)

7、脈先用石蠟包埋，在每個(gè)血管的近、中、遠(yuǎn)段的中點(diǎn)取材，每點(diǎn)連續(xù)取3個(gè)4μm的切片，切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢查。采用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)高分辨醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(HMIAP-2000)測(cè)量血管周長(zhǎng)和觀察p38MAPK陽性表達(dá)情況。血管橫截面積根據(jù)數(shù)學(xué)公式：半徑=周長(zhǎng)/2π、面積=π×半徑2計(jì)算得出；而p38MAPK陽性表達(dá)的量化分析采用文獻(xiàn)報(bào)道的一個(gè)量化評(píng)分表計(jì)算得出。方差分析(One-wayANOVA，LSD)和非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whi

8、tneyU)兩種統(tǒng)計(jì)方法用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 HE染色：對(duì)照組動(dòng)物的基底動(dòng)脈HE染色顯示組織結(jié)構(gòu)正常，基底動(dòng)脈外膜膠原纖維較薄。在day5，SAH組、SAH+DMSO組出現(xiàn)管徑狹窄、內(nèi)膜出現(xiàn)明顯皺褶、平滑肌細(xì)胞肥大、壞死、扭曲變形，外膜膠原纖維明顯增多變厚且有粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)；而在SAH+SB203580組基底動(dòng)脈管徑出現(xiàn)的一系列變化基本恢復(fù)：內(nèi)皮恢復(fù)平滑，只出現(xiàn)少量破損；平滑肌層細(xì)胞間隙基本恢復(fù)、外膜炎性反應(yīng)基本消失、膠原纖

9、維增生明顯緩解。在day7，所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物基底動(dòng)脈基本趨于正常。 免疫組織化學(xué)：p38MAPK在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，定位于胞膜和胞漿。對(duì)照組動(dòng)物基底動(dòng)脈p38MAPK免疫反應(yīng)輕微，幾乎沒有出現(xiàn)(量化評(píng)分為0)。SAH后day5，p38MAPK在SAH組、SAH+DMSO組動(dòng)物基底動(dòng)脈上的表達(dá)強(qiáng)烈(量化評(píng)分分別是2、1.80)，主要反應(yīng)在平滑肌細(xì)胞上，與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.01)。而SAH+SB203580組動(dòng)物基底

10、動(dòng)脈上p38MAPK的免疫反應(yīng)明顯減弱(量化評(píng)分為0.20)與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)，但與SAH組、SAH+DMSO組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在day7，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物基底動(dòng)脈平滑肌層p38MAPK表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。 以上結(jié)果顯示：兔枕大池二次注血模型基底動(dòng)脈在注血后day5時(shí)出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變：包括動(dòng)脈管腔狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞肥大及外膜膠原纖維增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變與

11、文獻(xiàn)報(bào)道人類SAH痙攣動(dòng)脈類似。免疫組織化學(xué)的研究顯示：兔基底動(dòng)脈注血后day5，基底動(dòng)脈出現(xiàn)明顯收縮的同時(shí)p38MAPK在平滑肌細(xì)胞上表達(dá)顯著增強(qiáng)；而在注血后day7兩者恢復(fù)到注血前水平，表明p38MAPK表達(dá)增強(qiáng)程度的變化與注血后CVS程度隨著時(shí)間的變化一致。應(yīng)用p38MAPK特異性抑制劑后，兔基底動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的改變不明顯，與對(duì)照組相似。平滑肌的收縮顯著緩解，同時(shí)p38MAPK的表達(dá)也明顯減輕。這些結(jié)果提示p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的

12、激活可能是遲發(fā)性CVS發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。 第二部分p38MAPK誘導(dǎo)的致炎細(xì)胞因子TNF-α在CVS中的作用 炎癥免疫反應(yīng)與CVS的關(guān)系密切，而誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子生成是p38MAPK一個(gè)重要的生物效應(yīng)。前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了激活的p38MAPK在遲發(fā)性CVS中的重要作用，本研究的目的就是進(jìn)一步的探討由p38MAPK誘導(dǎo)的致炎細(xì)胞因子在CVS發(fā)生、發(fā)展中的作用。30只雌性新西蘭白兔，體重2.8～3.0Kg，隨機(jī)分為5組：①對(duì)

13、照組；②SAH-day3組③SAH-day5組④SAH+DMSO組⑤SAH+SB203580組。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型。每只動(dòng)物在首次注血前和處死前行枕大池穿刺留取腦脊液1ml，以1500r/min的速度在離心機(jī)上離心15min，取上清，立即-80℃低溫保存。從day3開始，SAH+DMSO、SAH+SB203580兩組動(dòng)物，枕大池內(nèi)分別注入干預(yù)藥物DMSO、p38MAPK特異性抑制劑SB203580，持續(xù)到各組處死前一

14、天。動(dòng)物處死采用活體經(jīng)左心室灌注10％的緩沖中性甲醛。處死后，立即開顱取含有基底動(dòng)脈全長(zhǎng)的腦干及腦組織，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底動(dòng)脈先用石蠟包埋，在每個(gè)血管的近、中、遠(yuǎn)段的中點(diǎn)取材，每點(diǎn)連續(xù)取3個(gè)4μm的切片，切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢查。采用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)高分辨醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(HMIAP-2000)測(cè)量血管周長(zhǎng)和觀察p38MAPK陽性表達(dá)情況。血管橫截面積根據(jù)數(shù)學(xué)公式：半徑=周長(zhǎng)/2π、面積=π×半徑2計(jì)算

15、得出；而p38MAPK陽性表達(dá)的量化分析采用文獻(xiàn)報(bào)道的一個(gè)量化評(píng)分表計(jì)算得出。腦脊液中的TNF-α濃度采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定。方差分析(One-wayANOVA，LSD)、非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)、pearson相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)方法用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 以上結(jié)果顯示：在兔枕大池二次注血模型中，基底動(dòng)脈收縮的同時(shí)平滑肌細(xì)胞p38MAPK激活并持續(xù)高表達(dá)，而外周腦脊液中的致炎細(xì)胞因子TNF-α濃度明顯升

16、高并保持穩(wěn)定；應(yīng)用抑制劑干預(yù)后，痙攣的基底動(dòng)脈明顯緩解，平滑肌細(xì)胞p38MAPK表達(dá)不明顯，而外圍腦脊液中的致炎細(xì)胞因子TNF-α濃度顯著降低。pearson相關(guān)性分析顯示TNF-α濃度的變化與基底動(dòng)脈橫截面積的變化呈負(fù)相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.812，P=0.000)。提示由CVS的形成可能不是p38MAPK的直接作用的結(jié)果，而是與其所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。 結(jié)論 1、本研究系統(tǒng)觀察了兔二次枕大池注血模

17、型后，痙攣基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞p38MAPK的表達(dá)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)p38MAPK的激活和過度表達(dá)是引起CVS的主要原因。 2、觀察到二次注血后，兔腦脊液中致炎細(xì)胞因子TNF-α濃度變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度的變化與兔基底動(dòng)脈橫截面積的變化呈明顯的相關(guān)性，提出CVS可能是p38MAPK通過激活各種產(chǎn)細(xì)胞因子途徑，從而對(duì)細(xì)胞因子起到一個(gè)增量調(diào)節(jié)的結(jié)果，最終導(dǎo)致了血管平滑肌持續(xù)性的收縮的新理論。 3、觀察到p38MAPK特異