利用CRISPR-Cas9技術構建草莓抗鑲脈病毒植株體系的研究.pdf

1、草莓（Fragaria×ananassa.Duch.）是薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實含高濃度的類黃酮化合物，具有重要的保健功能和顯著的經濟價值，因此倍受消費者和種植者的喜愛。在草莓的生產過程中，為了保持優(yōu)良品種的經濟性狀，其主要采用匍匐莖埋壓及分株等營養(yǎng)繁殖技術繁育種苗，這導致了病毒病的不斷的積累和傳播，危害也日趨嚴重。目前，利用生物技術手段獲得草莓脫毒苗或抗病毒苗是避免病毒危害的唯一的有效途徑。然而，由于草莓脫毒苗仍然不具有對病

2、毒的強免疫力，栽培過程中依然會發(fā)生高頻率感染的可能性，所以需要定期重新培育和更換脫毒苗，這給生產上帶來了極大的不便，同時也造成了成本的增加。因此，利用生物技術直接培育抗病毒的草莓苗來抵抗病毒的危害，具有較大的現(xiàn)實意義和應用價值。
　　CRISPR/Cas9技術是自2013年興起的一種高效簡便的基因組編輯技術，目前已在動植物中得到廣泛應用。它主要是基于細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，由于其可用于對DNA進行定點編輯，并且可以同時作

3、用于多個靶位點，同時編輯多個基因，較常規(guī)轉基因方法具有明顯優(yōu)勢，且沉默效果更加徹底，因此越來越多的研究人員對其產生了濃厚興趣。本研究以‘紅顏’草莓(Benihoppe)，質粒pX330、pCAMBIA1302、pUC19為材料，通過DNA重組技術成功構建了可以在植物上使用的CRISPR/Cas9載體，并以栽培草莓的PD基因為靶位點，對構建的CRISPR/Cas9載體進行了初步的驗證，同時分別構建了可作用于SVBV病毒ORFⅣ序列和同時作

4、用于ORFⅣ、ORFⅥ序列的‘紅顏’草莓轉基因植株體系。主要研究內容和結果如下:
　　1.以質粒pX330、pCAMBIA1302、pUC19為材料，采用DNA重組技術構建CRISPR/Cas9載體。結果表明:Cas9序列通過重組已成功替換了pCAMBIA1302中mgfp序列，重組質粒構建成功，簡寫為pCC; sgRNA序列成功接入了pUC19的多克隆位點區(qū)，重組質粒簡寫為pSG，pCC和pSG共同組成了CRISPR/Cas9載

5、體的兩個基本載體。
　　2.選取‘紅顏’草莓PDS基因為靶位點，構建CRISPR/Cas9載體，通過農桿菌介導法轉化‘紅顏’草莓葉片，建立起草莓CRISPR/Cas9技術應用的遺傳轉化體系。結果表明:作用于PD基因靶位點的CRISPR/Cas9載體構建成功，轉化后在愈傷組織中能夠檢測到PDS基因靶位點內及鄰近區(qū)域的核苷酸突變，但未檢測到核苷酸的缺失和插入。建立的草莓CRISPR/Cas9技術應用的遺傳轉化體系為:葉片預培養(yǎng)3天;使

6、用OD600=0.1的農桿菌GV3101懸浮液侵染葉盤組織20分鐘;在含100μM乙酰丁香酮和50μM硫辛酸的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天;轉入含100μM井岡霉素A、250mg/L特美汀、250mg/L頭孢噻圬的延遲培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天;在含250mg/L特美汀、250mg/L羧芐青霉素、5mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)上進行選擇培養(yǎng)，之后逐漸提高潮霉素的濃度至10mg/L。
　　3.選取SVBV病毒的ORFⅣ和ORFⅥ序列為靶位點，分別構建作用于