經(jīng)腎動(dòng)脈移植脂肪干細(xì)胞對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 SD大鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定及大鼠急性缺血性腎損傷模型的建立。
　　目的:脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ASCs)分離培養(yǎng)和鑒定;建立大鼠急性缺血性腎損傷（ischemic acute kidney injury）模型。
　　方法:采用Ⅰ型膠原酶消化法獲取SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中的ASCs，貼壁法純化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

2、及生長過程，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。體外標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)下檢測此類細(xì)胞成脂、成骨等多向分化能力，并以FCM儀檢測其表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34和CD45。以無創(chuàng)動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉雙側(cè)腎蒂45min的方法建立大鼠iAKI模型，并檢測正常大鼠和iAKI大鼠再灌注24hr時(shí)的血肌酐(Scr)。結(jié)果:1.原代細(xì)胞呈短梭形或小多角形，貼壁集落生長，貼壁細(xì)胞經(jīng)3次傳代后，細(xì)胞大小及形態(tài)趨于一致，呈長梭形旋渦狀、放射狀生長。2.FCM鑒定ASCs細(xì)胞表面

3、抗原。
　　結(jié)果：CD29和CD90高表達(dá)，CD34和CD45低表達(dá)，符合ASCs公認(rèn)的免疫表型;在標(biāo)準(zhǔn)成脂誘導(dǎo)條件下，油紅O染色可見脂肪滴證實(shí)其可向脂肪細(xì)胞分化;在標(biāo)準(zhǔn)成骨誘導(dǎo)條件下，VonKossa染色可見礦化結(jié)節(jié)證實(shí)其可向成骨細(xì)胞分化。3.ASCs傳至第9代仍可保持平均每天1.33×104個(gè)的增值速度。4.正常大鼠血肌酐為41.67±5.92μmol/L，iAKI大鼠再灌注24hr時(shí)的血肌酐為261.99±5.091mol/

4、L。
　　結(jié)論:1.通過Ⅰ型膠原酶消化法可獲得較高純度的大鼠ASCs，細(xì)胞貼壁生長并且高表達(dá)CD29和CD90，低表達(dá)CD34和CD45，符合公認(rèn)的ASCs免疫表型。2.分離獲得的ASCs在標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞，多向分化潛能證實(shí)其為干細(xì)胞。3.大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中提取的ASCs自我更新能力旺盛，傳至第9代仍可保持較快增殖速度。4.iAKI大鼠24hr時(shí)血肌酐較正常大鼠顯著升高(P＜0.05)，iAKI

5、模型建立成功。
　　第二部分 經(jīng)左側(cè)腎動(dòng)脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究。
　　目的:探討經(jīng)左側(cè)腎動(dòng)脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷（iAKI）的治療作用。
　　方法:持續(xù)夾閉SD大鼠雙側(cè)腎蒂45min建立iAKI模型。將建模成功后的SD大鼠隨機(jī)分成兩組:對照組（再灌注后即刻經(jīng)左腎動(dòng)脈注射500μiPBS，n=30）、ASCs治療組（再灌注后即刻經(jīng)腎動(dòng)脈移植5×105 ASCs，n=30）。術(shù)后1

6、2、24、48、72hr和1wk時(shí)處死大鼠，取血、分離血清，分別測定血清肌酐值，光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理損傷及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增生情況，并進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評分和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:1.ASCs治療組Scr水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對照組(P＜0.05)。2.腎臟病理及腎小管間質(zhì)損傷評分提示:與對照組相比，治療組再灌注12、24和48hr時(shí)損傷顯著減輕。3.與對照組相比，治療組左側(cè)腎臟TUNEL染色和巨噬細(xì)胞浸潤染色積分再

7、灌注12、24、48、72hr和1wk時(shí)顯著降低(P＜0.05);核增殖抗原48hr時(shí)顯著增加(P＜0.05)，72hr和1wk時(shí)減少(P＜0.05)。與治療組右側(cè)腎臟相比，治療組左側(cè)腎臟于再灌注后24hr腎小管間質(zhì)損傷評分顯著降低(2.40±0.50，P＜0.05)，再灌注后1wk時(shí)，腎組織TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)，再灌注12、48、72hr和1wk時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤染色積分減少(P＜0.05)，再灌注后48hr時(shí)核增

8、殖抗原表達(dá)增加(P＜0.05)，再灌注后72hr和1wk時(shí)核增殖抗原表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:ASCs經(jīng)腎動(dòng)脈移植可顯著改善iAKI大鼠腎功能、減輕腎臟病理損傷和細(xì)胞凋亡、減少炎癥細(xì)胞浸潤、促進(jìn)損傷后修復(fù)。此外，直接移植ASCs的左腎在細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤、損傷修復(fù)方面均優(yōu)于右腎，提示ASCs進(jìn)入受損部位或受損附近部位后發(fā)揮了重要作用。
　　第三部分 經(jīng)左側(cè)腎動(dòng)脈移植后的ASCs在AKI大鼠體內(nèi)分布情況。

9、>　　目的:研究標(biāo)記后的ASCs經(jīng)大鼠左側(cè)腎動(dòng)脈移植后在AKI大鼠體內(nèi)分布情況。
　　方法:選擇CM-Dil標(biāo)記ASCs，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。參照第二部分方法制作大鼠iAKI模型，再灌注后即刻經(jīng)左腎動(dòng)脈移植5×105 CM-Dil標(biāo)記的ASCs，術(shù)后12、24、48、72hr和1wk時(shí)處死大鼠，制作冰凍切片，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，熒光倒置顯微鏡觀察腎、肺、肝、脾、心臟內(nèi)的CM-Dil陽性細(xì)胞的分布情況，并計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)雙

10、側(cè)腎臟單個(gè)腎小球內(nèi)平均ASCs數(shù)量。
　　結(jié)果:1.ASCs腎內(nèi)分布情況:CM-Dil陽性細(xì)胞主要分布于左側(cè)腎小球內(nèi)，其中移植后12hr和24hrASCs較多，48hr、72hr和1wk時(shí)ASCs數(shù)量逐漸減少;右腎所有時(shí)間點(diǎn)均未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞。2.ASCs在肺、肝、脾、心臟的分布情況:48hr、72hr時(shí)肺內(nèi)存在少量CM-Dil陽性細(xì)胞，12hr、24hr、1wk時(shí)未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞;48hr肝內(nèi)存在少量CM

11、-Dil陽性細(xì)胞，其他時(shí)間點(diǎn)未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞;脾臟和心臟在各時(shí)間點(diǎn)均未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞。2.12hr、24hr、48hr、72hr、1wk時(shí)單個(gè)腎小球內(nèi)CM-Dil陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為:6.33±1.75、5.67±1.15、4.5±1.05、3.43±1.06、2.5±1.29個(gè)。
　　結(jié)論:1.選擇CM-Dil標(biāo)記ASCs，進(jìn)行體內(nèi)示蹤并觀察其分布情況是可行的。2.經(jīng)左側(cè)腎動(dòng)脈移植的ASCs全部分布在左側(cè)腎